《RSC Chemical Biology》：A truncated nisin variant, lipidated at its C-terminus, displays improved stability and increased antibacterial activity against methicillin-resistant Staphylococcus aureusOpen Access
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细菌耐药性的上升已促使研究人员将注意力转向替代性抗菌药物，包括抗菌肽（AMPs）。一些天然存在的AMPs是脂质化的，显示出与临床使用的抗菌药物如达托霉素和多粘菌素（均为脂质化肽）的相似性。在本研究中，研究人员探究了不同脂质修饰对乳链菌肽（nisin）的影响。N
细菌耐药性的上升已促使研究人员将注意力转向替代性抗菌药物，包括抗菌肽（AMPs）。一些天然存在的AMPs是脂质化的，显示出与临床使用的抗菌药物如达托霉素和多粘菌素（均为脂质化肽）的相似性。在本研究中，研究人员探究了不同脂质修饰对乳链菌肽（nisin）的影响。Nisin是一种被充分研究的34氨基酸AMP，由核糖体合成并经翻译后修饰，对许多革兰氏阳性菌有效，并被广泛用作食品防腐剂。野生型nisin和两种截短形式nisin(1–31)和nisin(1–20)在C端分别与C4、C6、C8或C10脂尾偶联。针对两株革兰氏阳性菌评估了抗菌活性：耐甲氧西林金黄色葡萄球菌（MRSA）和耐万古霉素屎肠球菌（VRE）。研究结果表明，野生型nisin和nisin(1–31)的脂质化降低了其抗菌活性，其中最长链表现出最低的抑制效果。然而，nisin片段nisin(1–20)的脂质化，尤其是与C8偶联得到的化合物12，增强了其对金黄色葡萄球菌物种的抗菌活性和特异性，使其效力比野生型nisin高四倍。作用机制研究表明，脂质化构建体12保留了结合脂质II的能力，但不会诱导金黄色葡萄球菌中孔的形成。值得注意的是，由于其较短的长度、环保护结构和脂质修饰，该构建体对胰凝乳蛋白酶、胰蛋白酶和蛋白酶K表现出改善的蛋白水解稳定性。研究人员的发现表明，优化脂质-肽组合可以产生更有效、特异和稳定的抗菌开发候选物。
细菌耐药性已成为全球公共卫生重大威胁。自20世纪30年代抗生素问世以来，其在器官移植、外科手术和化疗等医疗程序中发挥着不可替代的感染预防作用。然而，耐药菌的不断出现使现有抗生素疗效下降。据预测，若当前趋势延续，到2050年抗菌药物耐药性（AMR）每年可导致1000万人死亡。因此，开发具有新作用机制的抗感染药物迫在眉睫。抗菌肽（AMPs）因其独特的膜破坏或靶向特定细胞成分的机制而备受关注。临床上使用的肽类抗生素如万古霉素、达托霉素和多粘菌素均为脂质化肽，脂质修饰对维持其结构、稳定性和抗菌活性至关重要。Nisin是一种由34个氨基酸组成的核糖体合成及翻译后修饰肽（RiPP），属于羊毛硫氨酸肽家族，通过结合脂质II并在细菌膜上形成孔道杀死革兰氏阳性菌，长期用作食品防腐剂。然而，nisin对蛋白酶敏感，易被肠道酶降解，限制了其治疗应用。已有的脂质化工程研究表明，脂质链长度和肽结构对抗菌活性影响复杂且难以预测。为此，研究人员系统评估了在nisin及其截短变体C端引入不同长度脂质链（C4、C6、C8、C10）后对抗菌活性、作用机制和稳定性的影响。
研究人员利用α-胰凝乳蛋白酶消化nisin，获得两个主要截短片段nisin(1–31)和nisin(1–20)，并通过BOP/PyBOP介导的酰胺偶联反应，将不同长度脂肪胺偶联至片段C端，制备了一系列脂质化衍生物。通过琼脂孔扩散法、微量肉汤稀释法测定最低抑菌浓度（MIC），结合spot-on-lawn实验、时间-杀菌曲线和钾离子外流实验阐明作用机制，并采用蛋白酶处理评价稳定性。菌株包括金黄色葡萄球菌LMG15975（MRSA）、LMG10147，屎肠球菌LMG16003（VRE）、LMG11423，蜡样芽孢杆菌CH-85，单核细胞增生李斯特菌LMG10470等，均来自LMG保藏中心。
**Nisin的C端脂质化降低其抗菌活性**：通过序列保守性分析发现，所有天然nisin变体的N端环结构高度保守，而C端线性区域可变。在优化脂质化条件后（肽与脂肪胺比例为400当量时产率最高达34%），研究人员制备了化合物2–5（nisin+C4、C6、C8、C10）。琼脂孔扩散实验表明，野生型nisin对屎肠球菌和金黄色葡萄球菌的抑制活性随脂链增长而下降，长链衍生物活性最低，说明在完整nisin的C端直接引入脂尾不利于抗菌活性。
**截短nisin变体的脂质化及其对抗菌活性的影响**：研究人员对nisin(1–31)和nisin(1–20)分别在组氨酸和天冬酰胺残基上进行脂质化，得到化合物6–9和10–13。活性测定显示，nisin(1–31)的脂质化同样导致活性下降；而nisin(1–20)本身无抗菌活性，但脂质化后恢复活性，其中C8修饰的化合物12对屎肠球菌和金黄色葡萄球菌的活性与野生型相当或更高。
**化合物12对金黄色葡萄球菌物种表现出改善的抗菌活性**：MIC测定结果显示，化合物12对金黄色葡萄球菌LMG15975（MRSA）的MIC为1.9 μg mL
?1，比未修饰的nisin(1–20)强16倍，比野生型nisin强4倍；对蜡样芽孢杆菌活性增强2倍。但化合物12对单核细胞增生李斯特菌和屎肠球菌的活性较野生型分别下降2倍和8倍，表明脂质化改变了抗菌谱。扩展菌株面板测试进一步确认化合物12对金黄色葡萄球菌、蜡样芽孢杆菌和粪肠球菌高效，而野生型对屎肠球菌和李斯特菌更有效，两者对大肠杆菌均无活性。
**化合物12结合脂质II但不诱导孔形成**：Spot-on-lawn实验显示，当外源脂质II存在时，化合物12的抗菌活性降低，表明其与脂质II发生竞争性结合。时间-杀菌曲线表明，化合物12抑制细菌增殖但不减少菌落形成单位，呈抑菌而非杀菌作用。钾离子外流实验（PBFI探针）显示，化合物12即使在8倍MIC浓度下也未引起显著的膜透化，说明其不形成膜孔。因此，化合物12的抗菌活性主要源于脂质II结合，而不依赖孔形成。
**化合物12对蛋白水解降解表现出增强的稳定性**：将nisin和化合物12分别暴露于胰蛋白酶、胰凝乳蛋白酶和蛋白酶K过夜，通过琼脂扩散法检测残余活性。野生型nisin在胰蛋白酶、胰凝乳蛋白酶和蛋白酶K处理后活性损失分别为约78%、70%和接近完全；而化合物12在胰蛋白酶和胰凝乳蛋白酶处理后活性损失小于25%，蛋白酶K处理后仍保留42%活性。这一稳定性归因于其较短长度、环保护结构以及C8脂尾的空间位阻保护了潜在切割位点（如Lys12）。
总结讨论：本研究表明，脂质化修饰的效果高度依赖肽序列、脂链长度和目标菌种。对完整nisin或较长的nisin(1–31)进行C端脂质化会干扰其C端成孔域的膜转位功能，导致活性下降；而对于缺少成孔域的nisin(1–20)，C8脂尾可能通过增强与膜或脂质II复合物的相互作用，使其以“仅结合脂质II”的抑菌机制高效发挥作用。此外，化合物12显著提高的蛋白酶稳定性是其MIC比野生型nisin低4倍的重要因素。该工作为脂肽类抗菌药物的理性设计提供了新思路。
研究结论：本研究探讨了靶向nisin或nisin片段C端修饰的脂质化工程策略。尽管大多数临床使用的非核糖体肽（NRP）抗菌肽是脂质化的，但此类修饰对新肽序列及其生物活性的影响通常复杂且不可预测。研究数据表明，效果高度依赖于肽序列、所用脂尾以及目标细菌。对nisin和nisin(1–31)的C端直接脂质化导致抗菌功效下降。相反，用C8链对截短的nisin(1–20)变体进行脂质化（化合物12）显著增强了其抗金黄色葡萄球菌（包括临床相关的MRSA菌株）的活性，使其效果比野生型nisin最多高四倍。由于其较短的长度、环保护结构和脂尾修饰，该构建体在暴露于胰蛋白酶、胰凝乳蛋白酶或蛋白酶K时也表现出显著增强的稳定性。数据表明，化合物12的稳定性提高对其高活性有重要贡献。总体而言，这项工作证明羊毛硫氨酸肽的脂质化可以引入增强的抗菌活性和改善的蛋白水解稳定性。
