《RSC Chemical Biology》：Discovery of PROTACs recruiting the E3 ligase CHIPOpen Access
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蛋白水解靶向嵌合体（PROTACs）是靶向蛋白降解（TPD）系统中具有前景的降解剂。尽管人类基因组中存在超过600种E3泛素（Ub）连接酶，但仅少数E3连接酶已被用于PROTACs。为应对由其突变引起的耐药性以及寻找适用于特定靶蛋白降解的候选E3连接酶，扩展可
蛋白水解靶向嵌合体（PROTACs）是靶向蛋白降解（TPD）系统中具有前景的降解剂。尽管人类基因组中存在超过600种E3泛素（Ub）连接酶，但仅少数E3连接酶已被用于PROTACs。为应对由其突变引起的耐药性以及寻找适用于特定靶蛋白降解的候选E3连接酶，扩展可用的E3连接酶资源至关重要。在本研究中，研究人员旨在开发利用先前未被使用的Hsc70羧基末端相互作用蛋白（CHIP）E3连接酶的新型PROTACs。研究人员设计并合成了通过连接子将CHIP配体与靶蛋白配体偶联的PROTACs。这些PROTACs与CHIP和靶蛋白形成三元复合物，并在体外泛素化靶蛋白。此外，利用CHIP不像其他用于PROTACs的E3连接酶那样是多亚基复合物这一特点，体外泛素化实验揭示CHIP不仅诱导典型的蛋白酶体降解信号——赖氨酸（K）48连接的多聚泛素（poly-Ub）链，还诱导K63连接。此外，它还诱导HaloTag蛋白和内源性溴结构域蛋白4（BRD4）的蛋白酶体依赖性降解。因此，研究人员成功扩展了PROTACs的E3连接酶工具箱。这些使用CHIP的新型PROTACs在靶蛋白上诱导含有混合连接poly-Ub链的非典型蛋白酶体降解信号，可应用于其他蛋白质的降解，尤其是疾病相关蛋白。
**研究背景与问题**
靶向蛋白降解（targeted protein degradation, TPD）是一种无需遗传操作即可降低靶蛋白丰度的新兴策略，能够通过传统小分子药物清除包括不可成药靶点在内的有害蛋白质。蛋白水解靶向嵌合体（proteolysis-targeting chimeras, PROTACs）是TPD策略中最具代表性的降解剂，其作为异双功能分子，通过连接子将E3泛素（ubiquitin, Ub）连接酶配体与靶蛋白配体偶联，使E3连接酶接近靶蛋白并介导其泛素化，进而被蛋白酶体降解。尽管人类基因组编码超过600种E3连接酶，但目前成功应用于PROTACs的仅有CRBN、VHL、IAPs和MDM2等少数几种。长期使用CRBN和VHL型PROTACs会导致肿瘤细胞产生耐药性，其机制涉及E3-PROTAC-靶蛋白相互作用界面热点区域的基因突变，从而改变三元复合物形成能力。为了克服此类耐药并寻找适合特定靶蛋白降解的E3连接酶，扩展PROTACs可用的E3连接酶资源十分必要。CHIP（carboxyl terminus of Hsc70-interacting protein）是由STUB1基因编码的U-box型E3连接酶，以不对称同源二聚体形式存在，包含N端TPR结构域和C端U-box结构域。CHIP通过TPR结构域识别Hsp70/Hsp90伴侣蛋白的C末端，并介导错误折叠客户蛋白的泛素-蛋白酶体系统（ubiquitin-proteasome system, UPS）降解。与其他多亚基Cullin-RING连接酶（CRLs）不同，CHIP是单蛋白E3连接酶，易于功能调控，且广泛表达于多种组织，底物包括p53、HER2、tau等疾病相关蛋白。然而，此前尚无利用CHIP的PROTACs报道。本研究旨在开发以CHIP为E3连接酶的新型PROTACs，拓展PROTACs的E3工具库。
**研究内容与总体结论**
研究人员以CHIP结合五肽LWWPD作为E3配体，分别与HaloTag配体和BRD4配体JQ1通过连接子偶联，合成了化合物1和2。通过荧光偏振（fluorescence polarization, FP）实验、pull-down实验、体外泛素化实验以及细胞水平降解实验，研究人员证实1和2均能与CHIP及靶蛋白形成三元复合物，诱导靶蛋白多聚泛素化，并以蛋白酶体和CHIP依赖性方式降解HaloTag和BRD4。值得注意的是，CHIP介导的靶蛋白多聚泛素链包含K48和K63连接，属于非典型蛋白酶体降解信号。该研究首次证明CHIP可作为PROTACs的E3连接酶，为克服PROTAC耐药和扩展可降解蛋白组提供了新策略。
**关键技术方法**（约200字）
本研究主要采用了以下技术方法：化学合成方法构建异双功能PROTAC分子；荧光偏振（FP）结合实验测定CHIP配体亲和力，使用FITC标记的LWWPD示踪剂；体外pull-down实验检测三元复合物形成，使用重组GST标记HaloTag和His标记CHIP；体外泛素化实验结合Western blot分析多聚泛素链连接类型，使用K48和K63链特异性抗体；荧光素酶报告基因检测HaloTag融合蛋白降解；Western blot检测内源BRD4蛋白水平；利用CHIP敲除（CHIP-KO）细胞系验证降解的E3依赖性。细胞系包括HeLa细胞（来自RIKEN BRC）和稳定表达HT-ELuc的HEK293细胞。
**研究结果**
（1）**化合物1的合成与CHIP结合亲和力**
研究人员设计并合成了靶向HaloTag的PROTAC 1，其中CHIP配体采用N端添加Cys-Gly的七肽H-CGLWWPD-OH，通过马来酰亚胺-半胱氨酸Michael加成与连接子偶联。FP饱和结合实验显示，FITC-Ahx-LWWPD与His6-CHIP结合的Kd为28.8 nM；竞争结合实验计算得到1对CHIP的抑制常数Ki为4.2 nM，表明1与CHIP具有强亲和力，与CHIPOpt肽相当。
（2）**CHIP与HaloTag三元复合物的形成**
通过pull-down实验，研究人员将GST标记的HaloTag（GST-HT）与不同浓度1预孵育，再加入His6-CHIP，利用谷胱甘肽亲和珠捕获复合物。结果显示，在1存在下His6-CHIP被GST-HT共沉淀，而缺乏1时无共沉淀；当1浓度高于10 μM时，共沉淀量下降，出现典型的钩状效应（hook effect），证明三元复合物的形成具有1依赖性。
（3）**体外泛素化及混合泛素链的生成**
体外泛素化实验使用E1（GST-UBE1-His8）、E2（UbcH5c）、His6-CHIP和泛素，以荧光素标记的GST-HT-FAM为底物。结果表明，在1存在下GST-HT-FAM出现高分子量弥散条带，且呈剂量和时间依赖；单独的CHIP配体11或HaloTag配体12不能有效诱导底物泛素化。通过两步纯化获得泛素化产物，Western blot分析显示多聚泛素链同时含有K48和K63连接，表明CHIP介导了非经典的混合泛素链信号。
（4）**化合物1诱导HaloTag的蛋白酶体依赖性降解**
在瞬时表达HaloTag-翡翠荧光素酶（HT-ELuc）的HeLa细胞中，1以浓度依赖方式降低荧光素酶活性：0.1、1、10 μM处理6小时分别使相对发光强度降至0.82、0.75和0.58。在稳定表达HT-ELuc的HEK293细胞中，3 μM的1诱导的降解被蛋白酶体抑制剂MG132、bortezomib和epoxomicin完全取消，证明1通过UPS降解HaloTag。
（5）**化合物2的合成及与BRD4-CHIP三元复合物的形成**
研究人员进一步合成了以JQ1为BRD4配体、以LWWPD为CHIP配体的PROTAC 2。在体外pull-down实验中，将His6-CHIP与2预孵育后加入HeLa细胞裂解液，通过Ni亲和珠捕获，Western blot检测到BRD4与His6-CHIP共沉淀，且该共沉淀依赖2的存在，证明2能够介导CHIP与内源BRD4形成三元复合物。
（6）**化合物2诱导内源BRD4降解及其机制**
在HeLa细胞中，2以浓度和时间依赖方式降低内源BRD4蛋白水平：1 μM处理6小时和24小时分别使BRD4降至对照的0.65和0.57；10 μM时降解效率略降，符合钩状效应。蛋白酶体抑制剂MG132和bortezomib预处理可完全阻断2诱导的BRD4降解；过量的CHIP配体11也能抑制降解，而单独的11、JQ1羧酸13或二者混合物均不改变BRD4水平。用MLN4924抑制CRL连接酶活性后，CRBN型PROTAC dBET1诱导的BRD4降解被显著抑制，但2诱导的降解不受影响，说明2的降解途径不依赖CRL。
（7）**CHIP依赖性验证**
在CHIP基因敲除（CHIP-KO）的HeLa细胞中，2诱导的BRD4降解完全消失，而在野生型HeLa细胞中降解正常。这一结果直接证实了2诱导的靶蛋白降解依赖于CHIP E3连接酶。
**讨论与结论**
研究人员指出，1和2虽能有效降解靶蛋白，但降解效率未超过50%。可能原因包括：含L-氨基酸的线性肽在细胞内半衰期短、连接子与肽之间的硫代琥珀酰亚胺键在胞内高谷胱甘肽浓度下易发生硫醇交换或retro-Michael反应而不稳定；此外，Hsp70-Hsp90组织蛋白（HOP）等含有TPR结构域的蛋白可能竞争性结合CHIP配体，或与其他E3连接酶协同影响降解。尽管存在上述限制，本研究仍首次成功将CHIP应用于PROTACs，证明单亚基U-box型E3连接酶可用于TPD，且其诱导的混合K48/K63多聚泛素链可促进蛋白酶体降解。新型可PROTAC化E3连接酶候选物的匮乏是该领域的研究热点。在本研究中，研究人员聚焦于参与疾病相关蛋白和未折叠蛋白降解的CHIP E3连接酶，设计并合成了由LWWPD五肽序列作为CHIP配体、通过连接子与靶蛋白配体（即公认的标签蛋白HaloTag和治疗靶点BRD4）偶联的PROTACs 1和2。1和2均与CHIP及其靶蛋白形成稳定的三元复合物，并在体外诱导泛素化。在哺乳动物细胞中，1和2在6小时内以1 μM浓度、以蛋白酶体和CHIP依赖性方式诱导靶蛋白降解。这些结果首次证明CHIP E3连接酶可用作PROTACs。此外，CHIP配体在生物稳定性、结合特异性、分子量和细胞渗透性方面仍有待改进，以提高靶蛋白降解效率。最近，Lucas等人已鉴定出小分子CHIP结合物，因此这种有效的CHIP配体可能用作PROTAC的弹头（warhead）。
