可见光响应型Au包覆NiTi–O纳米管促进人间充质干细胞成骨分化的研究

《RSC Advances》：Visible-light-responsive Au-coated NiTi–O nanotubes for enhancing osteogenic differentiation of human mesenchymal stem cellsOpen Access

　　

镍钛（NiTi）合金因其优异的超弹性、形状记忆行为、耐腐蚀性和生物相容性而被广泛用作牙科和骨科金属生物材料。然而，金属植入物的临床性能不仅取决于其本体性质，还取决于与周围细胞直接接触的植入物表面的化学成分、氧化层特性、表面粗糙度和纳米结构。由于间充质干细胞（mesenchymal stem cells, MSCs）的附着、增殖、成骨分化和基质矿化在骨整合早期阶段至关重要，因此增强金属表面生物活性的表面改性策略至关重要。通过阳极氧化制备的NiTi–O纳米管提供了高比表面积和有序纳米结构，能够调控细胞粘附、细胞骨架重组和成骨信号通路。金（Au）涂层的引入进一步提高了化学稳定性并引入了光热响应性，使光能能够转化为局部热刺激。表面等离子体共振（surface plasmon resonance, SPR）是指当入射光共振激发金属-介电界面时，导带电子的集体振荡，产生强烈的局部电磁场增强和波长选择性光吸收。在贵金属纳米结构中，这种共振使其在可见光-近红外区域具有高效的光热转换和光催化活性。因此，基于Au的纳米结构在可见光和近红外区域表现出高效的光吸收和光热转换能力。这些纳米结构不仅在癌症治疗中引起了广泛关注，还在抗菌表面工程、组织再生和功能性植入物设计中引起了浓厚兴趣。因此，Au纳米结构的尺寸、形态和组成被认为是决定其光吸收光谱和光热转换效率的关键因素。以往研究表明，Au包覆的NiTi–O纳米管表面在470 nm可见光照射下表现出光催化抗菌活性，表明这些材料可以作为可见光响应的纳米生物界面，而非仅仅是表面改性的金属基底。然而，以往的研究主要集中在抗菌活性上，尚不清楚相同的Au包覆NiTi–O纳米管平台是否也能在不同照射波长下调控细胞行为并增强成骨作用。本研究设计了Au包覆的NiTi–O纳米管表面作为可见光响应的纳米生物界面，用于调控人间充质干细胞（human mesenchymal stem cells, hMSCs）的成骨活性。研究人员假设600 nm照射将通过提供温和的光介导刺激而增强Au包覆纳米管表面上的成骨分化，且不损害细胞相容性。为验证这一假设，研究人员系统评估了表面形貌、hMSC活力、碱性磷酸酶（alkaline phosphatase, ALP）活性、成骨基因表达、基质矿化和热休克蛋白（heat shock protein, HSP）相关细胞反应。研究结果表明，纳米管制备、Au涂层和600 nm照射均表现出优异的生物相容性。在成骨条件下，600 nm照射增加了ALP活性，尤其是在纳米管表面上。在所有实验组中，600 nm照射的Au包覆纳米管表面表现出最高的骨桥蛋白（osteopontin, OPN）、骨钙素（osteocalcin, OCN）和骨涎蛋白-2（bone sialoprotein-2, BSP-2）表达，并在3周时表现出最大的基质矿化。HSP27和HSP70也升高，这与ANT在600和780 nm附近增强的可见光至近红外吸收相关的温和光热适应一致。YAP核定位和F-肌动蛋白组织主要与纳米形貌相关，而照射额外刺激了HSP相关反应。双因素方差分析显示，照射在1周时对ALP活性有影响，而在后期时间点，表面和照射效应均显著。仅在ALP（2周）、OCN、HSP27和HSP70上观察到显著交互作用。矿化表现出加性的、非交互的表面效应（P < 0.0001）和照射效应（P = 0.0010）。综上所述，这些发现表明ANT通过纳米形貌和光热机制促进成骨分化，这些机制在ALP、OCN和HSP反应水平上相互作用，但对终末期矿化贡献为加性效应。

一、研究背景与科学问题

镍钛（NiTi）合金凭借其优异的超弹性、形状记忆效应、耐腐蚀性和生物相容性，在口腔科和骨科领域被广泛用作金属生物材料。然而，金属植入物的临床表现不仅取决于其本体性能，更关键的是与周围细胞直接接触的植入物表面的化学成分、氧化层特性、表面粗糙度及纳米结构。间充质干细胞在骨整合早期的附着、增殖、成骨分化及基质矿化过程至关重要，因此开发能增强金属表面生物活性的表面改性策略成为该领域的研究重点。阳极氧化制备的NiTi–O纳米管（NTO）具有高比表面积和有序纳米结构，能够调控细胞粘附、细胞骨架重组和成骨信号通路。金（Au）涂层的引入则进一步提升了化学稳定性，并赋予材料光热响应能力，可将光能转化为局部热刺激。基于表面等离子体共振（SPR）效应，Au纳米结构在可见光和近红外区域表现出高效的光吸收和光热转换效率。以往研究已证实Au包覆NiTi–O纳米管在470 nm可见光下具有光催化抗菌活性，但该平台能否在不同波长照射下调控细胞行为并促进成骨分化尚不明确。本研究旨在探索600 nm可见光照射下Au包覆NiTi–O纳米管（ANT）作为可见光响应型纳米生物界面对人间充质干细胞（hMSCs）成骨活性的调控作用。

二、研究内容与主要结论

研究人员通过阳极氧化法制备NiTi–O纳米管，随后采用离子溅射进行Au包覆，构建了ANT表面。研究设置了未处理NiTi、NTO和ANT三种表面，每种表面又分为非照射组和600 nm LED照射组。通过系统评估表面形貌、细胞活力、ALP活性、成骨基因表达、基质矿化和HSP相关反应，研究人员发现：纳米管制备、Au涂层及600 nm照射均表现出良好的生物相容性；600 nm照射可增强成骨条件下的ALP活性，尤其在纳米管表面更为显著；ANT/600组在OPN、OCN和BSP-2表达上均达到最高水平，并在3周时表现出最大的基质矿化量。HSP27和HSP70的表达升高与ANT在600和780 nm附近的增强光吸收相关的温和光热适应一致。双因素方差分析揭示了照射对ALP活性的早期影响，以及后期表面和照射的联合效应；矿化表现为加性而非协同效应。该研究的重要意义在于证明了Au包覆NiTi–O纳米管表面可通过纳米形貌和光热机制协同促进成骨分化，为多功能牙科金属表面的开发奠定了基础。

三、主要关键技术方法

本研究采用了多项关键技术手段。表面形貌通过场发射扫描电子显微镜（FE-SEM）表征，元素分布采用球差校正扫描透射电子显微镜（STEM-Cs）结合能谱分析（EDS），表面化学态通过X射线光电子能谱（XPS）分析。细胞活力采用Live/dead荧光染色和MTT比色法评估。成骨分化早期标志物ALP活性通过酶学方法检测，成骨相关基因（OPN、OCN、BSP-2）及HSP27、HSP70的表达采用实时荧光定量PCR（qPCR）分析。基质矿化通过茜素红S（ARS）染色定量。此外，还进行了漫反射紫外-可见-近红外光谱分析以评估光学吸收特性。细胞实验使用人间充质干细胞（hMSCs，Lonza，第4–5代），照射条件为600 nm LED、5.5 mW cm^?2强度、每日10 min。

四、研究结果

1. 1.
   表面表征：FE-SEM证实NTO表面形成了均匀的纳米管结构，平均外径84.95 ± 5.25 nm，壁厚12.45 ± 1.57 nm，长度713.5 ± 16.0 nm。Au溅射后ANT保留了纳米管形貌，外径86.60 ± 5.70 nm。STEM-EDS显示Au信号集中在表面约100 nm范围内，XPS确认表面为金属态Au⁰覆盖的贫镍TiO₂氧化层。漫反射光谱显示ANT在可见光至近红外区域吸收增强，尤其在600和780 nm附近。
2. 2.
   细胞活力：Live/dead染色显示所有组别在24和48 h后绝大多数细胞呈绿色荧光，表明无显著急性细胞毒性。MTT结果显示所有组别均满足ISO 10993-5细胞相容性标准（≥70%活力）。48 h时表面类型对细胞活力有显著影响（P = 0.0004），但照射无显著主效应。
3. 3.
   ALP活性：1周时照射显著提高ALP活性（P < 0.0001），表面类型无显著效应。2周时表面和照射主效应均显著，且存在显著交互作用（P = 0.0207），照射仅在NTO表面显著提高ALP活性。
4. 4.
   成骨基因表达：2周时OPN、OCN和BSP-2均表现出显著的表面和照射主效应。OCN存在显著交互作用（P = 0.0337）。ANT/600组在三个基因中均表现出最高表达水平，其中BSP-2显著高于所有其他组。
5. 5.
   基质矿化：3周ARS染色显示表面（P < 0.0001）和照射（P = 0.0010）主效应均显著，但无交互作用，表明两者对矿化贡献为加性效应。ANT/600组矿化量最高，显著高于除ANT外的所有组。
6. 6.
   HSP相关基因：HSP27和HSP70均表现出显著的表面和照射主效应及交互作用。ANT/600组是唯一显著高于所有其他组的组别，照射仅在ANT表面显著提高HSP表达。

五、讨论与结论

讨论部分指出，ANT表面通过保留纳米管形貌和Au功能化，结合600 nm照射，实现了对hMSCs成骨分化的多维度调控。纳米形貌主要通过YAP核定位和F-肌动蛋白组织发挥机械转导作用，而照射则额外激活HSP相关适应性反应。表面温度测量显示ANT在15 min照射后可达45.9 °C，因此选择10 min照射时长以提供温和光热刺激。补充实验表明，42 °C热刺激与600 nm照射对HSP70表达的影响模式相似但未达显著差异，提示光生物学效应可能也参与其中。离子释放分析显示ANT的Ni释放低于NTO，且Au释放量小且稳定，证实了材料的结构和化学稳定性。研究局限性包括体外条件无法完全模拟口腔环境、基因表达样本量有限（n = 3）、HSP和YAP结果仅为相关性证据等。研究结论表明，ANT通过纳米形貌和光热机制促进成骨分化，这些机制在ALP、OCN和HSP反应水平上相互作用，但对终末期矿化贡献为加性效应，提示该平台可作为可见光响应的多功能牙科金属表面用于临床可及区域的骨整合增强。