自由基S-腺苷甲硫氨酸（rSAM）酶：超越天然反应性的new-to-nature化学平台

《RSC Chemical Biology》：Beyond native reactivity: radical SAM enzymes as platforms for new-to-nature chemistryOpen Access

　　

自由基S-腺苷甲硫氨酸（rSAM）酶构成了生物学中最大且最具多功能的酶超家族之一，催化多种自由基介导的反应，这些反应对代谢、辅因子生物合成、核酸修饰和天然产物形成至关重要。其化学核心是通过铁硫簇还原性裂解S-腺苷甲硫氨酸（SAM），生成高活性的5′-脱氧腺苷自由基（5′-dAdo˙），该自由基引发一系列具有挑战性的转化。最近的进展已将rSAM酶的反应性拓展至其天然角色之外，揭示了前所未有的机制灵活性和合成潜力。光化学活化策略现在能够在生物或化学光敏剂存在下实现[4Fe–4S]簇的光驱动还原，从而引发自由基形成。与此同时，钴胺素依赖性自由基SAM甲基转移酶利用相应的SAM类似物，为乙基和氟甲基转移化学开辟了新途径。值得注意的是，使用策略性工程化的稳定类似物，如7-脱氮腺嘌呤-四氮唑取代的F-SAM（F-7dz-tSAM），已成功克服了辅因子固有的降解问题。非经典自由基反应性，以ArsL催化的C–As键形成和NosL介导的光诱导三氟甲基化为例，展示了rSAM酶执行new-to-nature转化的能力。最后，将rSAM酶重新用于甲酰甘氨酸生成，实现了用于生物正交蛋白质标记的正交醛标签形成，进一步扩展了其在化学生物学中的用途。总的来说，这些进展确立了rSAM酶作为自由基生物催化、化学生物学和new-to-nature化学的多功能平台。

1. Introduction

天然界依赖自由基化学催化那些通过极性机制在热力学或动力学上难以实现的转化。自由基S-腺苷甲硫氨酸（rSAM）酶超家族是生物学中数量最多、多样性最丰富且化学上最具多功能的催化家族之一。此类酶介导代谢、辅因子生物合成、核酸修饰和天然产物生物合成中的多种关键反应。该超家族于2001年通过生物信息学分析首次被认识，其特征是保守的CxxxCxxC基序：三个半胱氨酸硫醇盐配位到[4Fe–4S]簇的三个铁上，而SAM通过其氨基和羧酸基团以双齿方式结合至第四个独特铁。后续研究已揭示该超家族在细菌、古菌和真核生物中广泛分布。迄今为止，rSAM酶已被认为与超过一百种不同的转化相关，包括氢原子提取、甲基化、硫插入、重排、脱羧、脱饱和和碳–碳键形成。代表性例子包括参与硫插入的BioB和LipA，参与[FeFe]-氢化酶成熟的HydE和HydG，参与四吡咯辅因子生物合成的HemN和NirJ，参与RNA修饰的RlmN和Cfr，以及催化复杂重排反应的MoaA和ThiC。rSAM酶还在核糖体合成和翻译后修饰肽（RiPP）的生物合成中发挥突出作用，催化碳–碳键、硫醚键形成、差向异构化、硫插入和脱氢等化学上要求苛刻的转化。这些天然转化为将rSAM酶重新定向于非天然底物和new-to-nature化学提供了丰富的机制基础。当前进展体现在多个层面：外部电子传递策略（特别是光化学还原）为自由基引发提供更强控制；SAM类似物工程扩展了可转移基团的种类；选定rSAM酶的催化混杂性或工程化使非经典成键反应和位点选择性生物分子修饰成为可能；辅因子再生、反应工程和蛋白质设计的进展正在解决rSAM催化的操作局限性。

2. Radical initiation and diversification in radical SAM enzymes

大多数已表征的rSAM酶共享一个通用的自由基引发框架：SAM通过其氨基和羧酸基团结合至[4Fe–4S]簇的独特铁上。簇从[4Fe–4S]²⁺还原至[4Fe–4S]¹⁺促进对SAM的内球电子转移以及S–C5′键的均裂，产生甲硫氨酸和5′-脱氧腺苷自由基（5′-dAdo˙）。这种裂解的区域选择性源于还原态SAM的电子结构与活性位点环境的相互作用。单电子还原产生Jahn–Teller活性的R₃S⁰态，其中锍中心的畸变有利于反键电子定域到特定的S–C键。然而，Jahn–Teller效应仅实现选择性键弱化，并不决定具体断裂哪个S–C键；该选择性由酶活性位点通过结合SAM的构象约束施加。谱学和动力学研究揭示SAM裂解可经历有机金属中间体Ω，该中间体包含簇独特铁与腺苷片段之间的Fe–C5′共价键，可短暂捕获新生的5′-dAdo自由基，随后Fe–C键均解释放活性物种。5′-dAdo自由基并非唯一可通过rSAM依赖的SAM裂解获得的自由基物种。在Dph1–Dph2系统中，SAM在Cγ–S键处裂解，生成5′-甲硫腺苷（MTA）和3-氨基-3-羧丙基（ACP）自由基，后者在二苯酰胺生物合成中转移到延伸因子2。结构研究支持形成有机金属ACP–铁中间体，并表明替代性SAM结合取向使Cγ–S键靠近簇的独特铁。此外，在HydG的低温光解研究中，[4Fe–4S]¹⁺–SAM复合物可产生甲基自由基；将SAM替换为S-腺苷-l-乙硫氨酸（SAE）则产生相应的乙基自由基。这些发现表明，SAM结合几何和SAM类似物结构是决定自由基身份的关键因素。

3. Photochemical control of radical SAM catalysis

rSAM酶的传统活化需要将催化[4Fe–4S]²⁺簇还原至[4Fe–4S]¹⁺态，其还原电位通常在?400至?750 mV之间。体外研究常用黄素氧还蛋白/黄素氧还蛋白还原酶/NADPH（Fld/Fpr/NADPH）系统或连二亚硫酸钠（DTH）作为还原剂，但二者分别受限于弱还原能力或化学不稳定性及副反应。光驱动光引发成为一种有前景的替代策略。早期工作使用5-脱氮核黄素作为光还原剂，虽能促进簇还原但量子效率低。2023年，研究人员引入遗传编码的光敏剂蛋白（PSP2），其在405 nm照射和牺牲电子供体NADH存在下形成超还原自由基（E° ≈ ?1.14 V），能够还原BtrN的催化簇和连二亚硫酸盐无法接近的辅助簇，并驱动底物转化；PSP2也能激活非经典rSAM酶Dph2，实现SAM的Cγ–S裂解和底物修饰。随后，研究人员开发了基于小分子光敏剂曙红Y（EY）的催化平台：在450 nm蓝光照射和NADH存在下，EY可有效还原多种rSAM酶的[4Fe–4S]簇，包括ThiH、NosL、ArsS、AprD4、HemN、BlsE和ArsL，反应产率和总周转数（TTN）较DTH体系提高5至10倍。EY体系还适用于研究氧化还原化学计量：ArsS催化的腺苷化反应无需NADH即可进行，由底物衍生的自由基中间体将电子回传给氧化态簇；在NosL催化的2-甲基-3-(吲哚基)丙烯酸（MIAA）反式中，无NADH时主要生成烯烃产物，加入NADH后则生成烷烃产物，表明可通过调节还原剂可用性控制产物选择性。尽管光化学还原具有优势，但强还原性光敏剂可能引发非生产性电子传递途径，其兼容性需针对具体酶和条件进行评估。

4. Alkyl transfer using SAM analogues by cobalamin-dependent radical SAM methyltransferase

自由基SAM甲基转移酶（RSMT）可催化非亲核底物的甲基化，每个催化循环消耗两分子SAM：一分子用于通过还原性SAM裂解形成5′-dAdo˙，另一分子作为甲基供体。根据序列和机制，RSMT分为三类：A类（如RlmN和Cfr）使用甲基化半胱氨酸作为瞬时甲基载体；B类含有钴胺素辅因子；C类为HemN样蛋白。其中B类钴胺素依赖性RSMT将SAM的单电子反应性与钴胺素的基团转移化学结合，能够在惰性碳中心上甲基化。SAM的固有不稳定性和化学计量消耗限制了长期催化。研究人员开发了一种基于多聚磷酸驱动的腺嘌呤补救途径的仿生SAM再生平台，可从副产物S-腺苷同型半胱氨酸（SAH）和5′-脱氧腺苷（5′-dA）再生SAM，并支持从l-乙硫氨酸合成SAE。该体系可实现谷氨酰胺C-甲基转移酶（QCMT）的肽底物甲基化和乙基化（后者产率约7%）。此外，利用卤代甲基转移酶（HMT）从SAH和氟碘甲烷（CH₂FI）原位合成氟化SAM类似物（F-SAM），多种钴胺素依赖性RSMT（包括QCMT、Mmp10、GenD1、CysS和TokK）可催化未活化sp³碳上的C–CH₂F键形成。反应中检测到5′-dA副产物和氟甲基钴胺素（FMeCbl）中间体，支持自由基氟甲基转移机制。针对F-SAM的化学不稳定性，研究人员通过生物电子等排取代策略工程化了稳定类似物7-脱氮腺嘌呤-四氮唑取代的F-SAM（F-7dz-tSAM）。该类似物能被CysS识别并裂解产生7-脱氮-5′-脱氧腺苷自由基，在酶联体系中获得显著高于不稳定F-SAM的产物产率，证明理性设计的SAM类似物可克服辅因子降解问题并保持自由基反应活性。

5. New-to-nature chemistry and biotechnological applications of radical SAM enzymes

在操控自由基引发和辅因子反应性之外，利用rSAM酶固有的底物耐受性也是扩展其生物技术应用的策略。硫醚形成型rSAM成熟酶PapB表现出广泛的底物耐受性，可接受含D-氨基酸、β-氨基酸和N-甲基化残基的底物，催化结构多样的肽大环化，为生成多样化大环肽提供了平台。

5.1. New-to-nature and preparative C–As bond formation catalyzed by ArsL

阿斯新硫菌素（AST）是一种广谱抗生素，靶向原核谷氨酰胺合成酶，并对疟原虫具有抑制活性。来自伯克霍尔德氏菌的ArsL是一种非经典rSAM酶，通过SAM的Cγ–S键裂解产生MTA和ACP自由基，后者加成至As(III)生成AST-OH。在D₂O中反应观察到副产物高丙氨酸的氘掺入，证实ACP自由基的形成。底物范围研究表明ArsL作用于三价砷底物；对五价砷底物，需通过二硫苏糖醇（DTT）原位还原为三价态才能被转化。ArsL C末端的RCCLKC基序中三个半胱氨酸残基介导As(III)的结合。突变体MCCA因可能抑制非生产性二硫键级联而表现出最高催化效率，使用10 mM甲基砷酸（MAsV）时底物转化率超过99%，总周转数超过200，较先前报道提高约100倍。利用过表达MCCA变体的细胞裂解液进行体外[4Fe–4S]重建后，在250 mL反应体积中从2 mM MAsV半制备规模合成AST，3小时内获得约0.1 g产物（定量产率）。

5.2. Light-driven trifluoromethylation catalyzed by NosL

NosL是来自放线菌的色氨酸裂解酶，天然催化l-色氨酸裂解产生3-甲基-2-吲哚酸。在光化学条件下，蓝色光照射和曙红Y存在时，NosL的天然反应产率显著高于连二亚硫酸盐体系。基于其底物混杂性，研究人员进一步将其应用于l-色氨酸C2位的三氟甲基化，使用Togni试剂II或Umemoto试剂作为三氟甲基供体。筛选光催化剂发现三(联吡啶)钌(II)（[Ru(bpy)₃]²⁺）对该转化有效。破坏[4Fe–4S]簇配位的C95A突变体完全消除产物生成；向反应中加入SAM会显著降低三氟甲基化效率，表明SAM与Umemoto试剂竞争活性位点结合。这些结果证明NosL可作为光活化自由基生物催化剂，将酶促自由基引发与合成三氟甲基化化学结合。

5.3. Bioorthogonal protein labeling using radical SAM enzymes

蛋白质标记是化学生物学中可视化和修饰靶蛋白的重要策略，其中醛基因其体积小和化学选择性受到关注。传统醛标签技术基于硫酸酯酶生物合成，将（C/S）X(P/A)XR基序中的Cys/Ser转化为甲酰甘氨酸（FGly）。rSAM酶为扩展醛标签技术提供了替代途径。厌氧硫酸酯酶成熟酶AtsB可催化醛标签基序中的半胱氨酸或丝氨酸转化为FGly，来自 Methanosarcina mazei 的AtsB能修饰非经典丝氨酸型标签，SAPAR基序支持高效FGly形成和荧光标记。RiPP环合酶SjiB显示出异常的催化混杂性，可在不需要前导肽的情况下将最小五残基底物中的丝氨酸氧化为FGly，随后被重新设计为专用的FGly生成酶。由此开发的YQSSI醛标签与经典硫酸酯酶来源的基序生物正交，不仅支持体外标记，还可在E. coli细胞中直接实现蛋白质标记，拓宽了rSAM酶在生物正交蛋白标记领域的应用。

6. Outlook

rSAM酶在自然界催化广泛而多样的转化，但其作为实用生物催化和化学生物学平台仍处于早期阶段。主要实际限制之一是催化依赖氧敏感的Fe–S簇，其异源表达和纯化需要严格的厌氧条件。未来应建立能在可操作厌氧条件下维持催化活性的稳健生物催化体系；细胞裂解液和全细胞体系可能通过避免蛋白纯化并提供细胞内的Fe–S生物合成和氧化还原支持而成为有价值的替代方案。此外，高效的电子传递和SAM供给仍是重要挑战。研究人员已通过代谢工程构建了具有短路SAM循环的大肠杆菌菌株，通过合成甲基供体直接甲基化SAH来维持细胞内SAM池，该策略虽尚未应用于rSAM酶，但为全细胞rSAM催化提供了潜在途径。改进SAM再生策略对于使用纯化rSAM酶或细胞裂解液的生物催化至关重要，尤其是需要SAM类似物时。蛋白质工程为提高催化效率、选择性和底物范围提供了有前景的途径，将推动rSAM生物催化从概念验证走向实际合成应用。