一种红色荧光化学传感器检测心肌肥厚模型中超氧阴离子的研究

《RSC Advances》：Red-emitting chemosensor detects superoxide anion in models of myocardial hypertrophyOpen Access

　　

心肌肥厚是心脏对长期应激产生的一种代偿性病理改变，目前缺乏合适的诊断方法。研究表明，在该疾病进展过程中超氧阴离子（O2˙?）水平升高。研究人员理性设计并合成了一种红色发射荧光化学传感器DO。该传感器能够在溶液中灵敏、准确地检测O2˙?，检出限（LOD）低至93 nM。化学传感器DO在体外检测到由血管紧张素II（Ang II）诱导的O2˙?浓度升高，并显示氯沙坦能够拮抗Ang II诱导的O2˙?产生。该传感器被应用于检测肥厚小鼠心脏组织切片中升高的超氧化物水平。因此，这一探针为理解心肌肥厚的发病机制提供了新的视角。

研究背景与问题

心肌肥厚是一种以心肌细胞体积增大和室壁增厚为特征的病理状态，其核心病因是心肌长期承受异常机械负荷或神经体液因子刺激，导致心肌重构。目前心肌肥厚的诊断主要依赖影像学、心电图（ECG）和血液生物标志物。然而，心脏成像对轻度肥厚敏感性不足且设备成本高；心电图虽便捷廉价但特异性低；血液检测虽可测量心肌损伤标志物如肌钙蛋白和脑钠肽（BNP）等，但缺乏直接靶向心肌肥厚病理变化的特异性生物标志物。因此，亟需识别心肌肥厚的特异性生物标志物以实现早期诊断和疗效评估。

研究发现，活性氧（ROS）水平在心肌肥厚进展早期显著升高。例如，在大鼠主动脉缩窄模型中，心肌组织内ROS水平在肥厚发生前即明显增加，且ROS水平与心肌肥厚程度呈剂量依赖性正相关。ROS是一类高反应性含氧分子或离子的统称，主要包括超氧阴离子（O₂˙^?）、过氧化氢（H₂O₂）、羟基自由基（˙OH）和过氧亚硝酸盐（ONOO^?）等。其中，O₂˙^?是体内产生的第一种ROS，可通过线粒体呼吸链、NADPH氧化酶等途径生成，并能进一步反应生成其他ROS，因此能在一定程度上代表总ROS浓度。现有体内检测O₂˙^?的方法如电子自旋共振（ESR）、酶学分析和电化学方法大多基于离体样本分析，对生物样本破坏性强且缺乏时空分辨率。因此，需要一种高生物相容性、可实现体内成像的检测方法。

为此，研究人员设计了一种新型荧光化学传感器，用于监测心肌肥厚中O₂˙^?的动态变化。该传感器在水溶液、心肌细胞和心肌组织中均能特异性响应O₂˙^?，并以红色荧光信号作为读数，从而将O₂˙^?鉴定为心肌肥厚的关键因子，可作为辅助指标评估肥厚相关的氧化应激。

关键技术方法

研究人员采用的主要技术方法包括：荧光光谱分析法进行体外传感性能测试；共聚焦荧光显微镜成像技术用于活细胞和心肌组织切片的荧光成像；蛋白质免疫印迹法（Western blot）检测心肌肥厚标志物心房钠尿肽（ANP）和脑钠肽（BNP）的蛋白表达水平；麦胚凝集素（WGA）染色用于评估心肌细胞横截面积。动物实验使用了雄性C57BL/6小鼠（4-6周龄，购自湖南斯莱克景达实验动物有限公司）。

研究结果

设计与合成荧光化学传感器

研究人员选用二氰基异佛尔酮作为荧光团骨架，该荧光团具有良好的生物相容性、红色发射和大斯托克斯位移。识别基团为三氟甲磺酸酯，其通过O₂˙^?的亲核攻击而被消除，暴露出荧光团上的酚羟基。同时在酚的邻位引入氯原子以降低分子的整体pKa，有利于反应后形成供电子能力更强的酚盐阴离子，从而增强荧光强度。最终成功合成了化学传感器DO。

光谱性质及对O₂˙^?的光学响应

在含有30% DMSO的10 mM PBS缓冲液（pH 7.4）中，DO溶液在440 nm处有吸收峰。加入O₂˙^?后，最大吸收波长红移至500 nm。荧光发射光谱显示，DO初始荧光极弱，随着O₂˙^?加入，在698 nm处的荧光强度急剧增加，最终增强25倍。在0-2 μM浓度范围内，荧光强度与O₂˙^?浓度呈良好线性关系。高分辨质谱（HRMS）证实DO通过脱保护暴露染料羟基的方式响应O₂˙^?。反应后的荧光量子产率达到66.7%，检出限（LOD）为93 nM。选择性实验表明，其他ROS、亲核试剂、生物还原剂和金属离子均不能触发DO的脱保护和荧光增强，证明其优异的选择性。pH影响实验显示，在中性和碱性条件下DO对O₂˙^?响应显著。动力学研究表明，加入O₂˙^?后1分钟内荧光强度迅速增加约10倍，并在30分钟左右达到平台期。

细胞毒性及荧光成像

细胞毒性实验显示，即使与高浓度DO（50 μM）孵育12小时，细胞死亡率仍低于20%，表明其低生物毒性。光稳定性测试表明DO在365 nm LED照射30分钟内吸光度下降小于10%。在RAW264.7巨噬细胞中，单独孵育DO的对照组几乎无红色荧光；经脂多糖（LPS）预处理12小时的细胞显示出强烈的红色荧光，强度约为对照组的4.5倍；而加入自由基清除剂TEMPO后荧光显著减弱，证明DO能灵敏反映细胞内O₂˙^?浓度的波动。

细胞共定位

亚细胞共定位实验结果显示，DO与内质网（ER）追踪器的皮尔逊共定位系数为0.89，与高尔基体为0.79，与溶酶体为0.52，与线粒体为0.47，与脂滴为0.34，与细胞核为0.24。这表明DO分布于细胞质和各种细胞器中，对内质网具有较高选择性。

心肌肥厚的细胞诊断

在H9c2大鼠心肌细胞中，对照组荧光微弱；经Ang II（100 nM）处理48小时后，荧光强度增加约4.8倍，呈现亮红色荧光；而经氯沙坦（Los）预处理的细胞荧光强度降至接近对照组水平。蛋白质免疫印迹结果显示，Ang II处理显著增加了心肌肥厚标志物ANP和BNP的表达，而Los则减弱了这一增加。CCK-8细胞活力测定显示，Ang II处理48小时使心肌细胞活力降低50%，而Los处理使细胞活力恢复至约80%。

肥厚心脏的心肌切片分析

在Ang II诱导的心肌肥厚小鼠模型中，肥厚组心肌组织的荧光强度显著高于对照组，约为2.5倍，表明肥厚小鼠心脏中O₂˙^?大量爆发。同时，WGA染色显示肥厚组心肌细胞横截面积约为正常对照组的1.3倍。这些数据表明DO能够检测肥厚小鼠心脏组织中升高的O₂˙^?水平，从而反映心肌肥厚相关的氧化应激。

总结与结论

研究人员设计并合成了靶向细胞内O₂˙^?的荧光化学传感器DO。该传感器具有快速响应（1分钟内荧光增强约10倍）、高选择性和低检出限（93 nM）等优势。该探针被应用于评估心肌肥厚细胞模型中的O₂˙^?浓度。此外，蛋白质免疫印迹揭示了心肌肥厚的进展与O₂˙^?爆发相关，且这种爆发可被氯沙坦抑制。最后，在肥厚小鼠的心脏组织切片中，DO可视化了升高的O₂˙^?水平，观察到的趋势与经典WGA染色结果一致。因此，化学传感器DO可作为荧光成像工具，用于监测心肌肥厚细胞和组织模型中O₂˙^?的积累。