## 中文标题 负载小檗碱的Ag–ZnO双金属纳米颗粒在缓解四氯化碳（直接）与四氧嘧啶（间接）诱导的白化大鼠氧化应激中的肝肾保护效应

《RSC Advances》：Hepatorenal protective effect of berberine-loaded Ag–ZnO nanoparticles in mitigating carbon tetrachloride (direct) and alloxan-induced oxidative stress (indirect) in albino rat modelsOpen Access

　　

肝肾毒性源于化学性或代谢性损伤机制中产生的慢性氧化应激（oxidative stress, OS）。本研究探讨了四氯化碳（CCl₄）和四氧嘧啶所诱导的肝肾毒性，以及负载小檗碱（berberine, BBR）的银–氧化锌纳米颗粒（Ag–ZnO NPs）在减轻该损伤中的肝肾保护潜力。研究人员采用紫外–可见光谱（UV-vis spectroscopy）、X射线衍射（XRD）、傅里叶变换红外光谱（FTIR）、透射电子显微镜（TEM）、动态光散射（DLS）、zeta电位及热重分析（TGA）对合成的纳米颗粒进行了表征。合成的纳米颗粒在尺寸、形状和结晶度方面表现出特征性的理化性质。体内研究表明，CCl₄给药直接改变了肝肾功能参数水平，这归因于过量活性氧（reactive oxygen species, ROS）的产生削弱了抗氧化防御系统；而四氧嘧啶直接靶向胰腺β细胞，升高血糖水平，产生ROS，并通过持续性高血糖引发继发性肝肾损伤。两种模型中的脂质谱均受到破坏，总胆固醇（total cholesterol, TC）、甘油三酯（triglycerides, TG）和低密度脂蛋白（low-density lipoprotein, LDL）水平升高，而高密度脂蛋白（high-density lipoprotein, HDL）水平降低。组织病理学分析也显示肝脏和肾脏结构发生显著改变。研究发现，BBR负载的Ag–ZnO NPs凭借其抗氧化和抗炎活性，在CCl₄诱导的毒性模型中能更好地恢复肝肾功能参数，血清TC、TG和LDL水平降低，HDL水平升高，内源性抗氧化防御系统得到更大程度的恢复，肝脏和肾脏的结构完整性也恢复至正常状态。总之，与四氧嘧啶诱导的间接（代谢性）毒性相比，BBR负载的Ag–ZnO NPs在克服CCl₄诱导的氧化应激直接毒性方面展现出卓越潜力。

## 论文解读

### 一、研究背景与目的

肝肾毒性（hepatorenal toxicity）被定义为肝脏和肾脏的同步损伤或功能障碍，其核心驱动因素是氧化应激（oxidative stress, OS）。氧化应激源于活性氧（reactive oxygen species, ROS）和活性氮（reactive nitrogen species, RNS）的过量产生，超出机体抗氧化防御能力，从而触发一系列分子事件，损害肝肾功能与结构。在肝脏中，活化的库普弗细胞、NADPH氧化酶和线粒体功能障碍协同引发脂质过氧化、肝细胞凋亡、星状细胞活化和纤维化，长期可进展为肝硬化和肝细胞癌。在肾脏中，线粒体功能障碍、脂质过氧化和蛋白质氧化导致间质炎症、肾小管损伤、肾小球滤过率下降及抗氧化剂耗竭。此外，晚期肝病还可通过内毒素血症、门静脉高压和全身性炎症加剧氧化应激，形成加重肾衰竭的恶性循环。

四氯化碳（CCl₄）和四氧嘧啶（alloxan）是两种广泛使用的肝肾毒物。CCl₄经肝脏细胞色素P450生物激活后形成三氯甲基自由基（CCl₃˙）和三氯甲基过氧自由基（CCl₃OO˙），破坏膜完整性、引发脂质过氧化和炎症，导致组织病理学改变和肝功能酶升高。四氧嘧啶则通过ROS介导的β细胞破坏诱导实验性糖尿病，进而对肝和肾组织造成氧化损伤。传统治疗手段如N-乙酰半胱氨酸、皮质类固醇、血管紧张素转换酶抑制剂和利尿剂等虽在特定临床情境下有效，但存在器官交叉毒性、长期并发症和副作用等局限，且主要缓解症状而非促进组织修复。在资源有限的地区，药物可及性和成本也是重大挑战。

小檗碱（berberine, BBR）是一种来源于小檗属植物的生物碱，已证明通过激活Nrf2信号通路和抑制NF-κB信号通路发挥双重肝肾保护作用，改善内源性抗氧化防御、减少组织损伤并恢复生化标志物。然而，其首过效应、生物利用度低、溶解性差和快速代谢限制了临床应用。将生物活性化合物封装入纳米颗粒可改善溶解性、增加细胞吸收、靶向受损组织并减少脱靶效应。银（Ag）和氧化锌（ZnO）纳米颗粒已被报道具有肝肾保护潜力，且Ag–ZnO双金属纳米颗粒的抗氧化和抗炎活性优于单金属纳米颗粒。因此，本研究旨在比较BBR负载的Ag–ZnO双金属纳米颗粒对CCl₄诱导和四氧嘧啶诱导的肝肾毒性的治疗效果，评估其增强的抗炎和抗氧化活性及肝肾生物相容性。

### 二、关键技术方法

研究人员采用化学共沉淀法通过单锅反应合成Ag–ZnO双金属纳米颗粒，以硝酸银和乙酸锌二水合物为前体盐，NaOH为沉淀剂，并在pH 12条件下反应2小时。随后将BBR溶液（2.5 mg mL^?1乙醇）与Ag–ZnO NPs按1:1比例在40°C下搅拌负载3小时，并通过UV-vis分光光度法测定包封效率（99.09%）。表征手段包括UV-vis光谱、XRD、FTIR、TEM、DLS、zeta电位和TGA。生物相容性通过红细胞溶血实验和卤虫致死实验评估。体内实验使用54只雌性白化大鼠（140–170 g，购自巴基斯坦拉合尔兽医与动物科学大学生物化学与生物技术研究所），分为CCl₄和四氧嘧啶两种毒性模型，每种模型包含阴性对照、阳性对照及三个治疗组（T1/Y1为游离BBR，T2/Y2为Ag–ZnO NPs，T3/Y3为BBR-loaded Ag–ZnO NPs）。肝肾功能参数、脂质谱和血清氧化应激标志物使用商业试剂盒检测，组织样本经H&E染色进行组织病理学评估。统计分析采用Brown–Forsythe和Welch's ANOVA及Dunnett's T3多重比较检验，p ≤ 0.05为显著。

### 三、主要研究结果

**纳米颗粒表征。** UV-vis光谱显示Ag–ZnO NPs在346、380和418 nm处有三个特征吸收峰，BBR负载后红移至360和424 nm，表明BBR与NPs之间的非共价结合和表面络合。XRD分析确认了ZnO的六方纤锌矿结构和Ag的面心立方结构，BBR负载后出现新的弱衍射峰，晶粒尺寸由19.291 nm增至22.659 nm。FTIR光谱中Zn–O伸缩振动峰的位移及新峰的出现证实了BBR成功负载。TEM显示Ag–ZnO NPs平均粒径22.42 nm，BBR负载后增至28.30 nm。DLS测定水合直径为77.32 nm（Ag–ZnO）和86.08 nm（BBR-loaded），PDI分别为0.248和0.182。zeta电位从?4.68 mV变为?26.9 mV，表明BBR负载后胶体稳定性提高。TGA显示BBR负载后重量损失从5%增至15.9%，证实有机涂层附着。稳定性研究显示6个月内两种制剂的光学性质基本保持稳定。

**生物相容性。** 溶血实验显示所有制剂在25–400 μg mL^?1浓度范围内溶血率均低于5%（BBR-loaded Ag–ZnO NPs最高2.62%），符合ASTM F756标准。卤虫致死实验中，BBR-loaded Ag–ZnO NPs的LC₅₀值（42.6 μg mL^?1）高于Ag–ZnO NPs（23.2 μg mL^?1），表明表面功能化降低了急性毒性。

**糖尿病确认。** 四氧嘧啶给药后阳性对照组血糖从130.33 ± 7.50 mg dL^?1升至406.33 ± 9.55 mg dL^?1，确认糖尿病诱导成功。Y3组（BBR-loaded Ag–ZnO NPs）血糖从158 ± 7.21降至145.33 ± 7.76 mg dL^?1，提示β细胞功能部分恢复。

**肝功能参数。** CCl₄模型显示ALT、AST、ALP和总胆红素显著升高，白蛋白和总蛋白降低；四氧嘧啶模型呈现较缓慢的代谢性损伤。BBR-loaded Ag–ZnO NPs在CCl₄模型中更显著地恢复了这些指标，与BBR和NPs的协同抗氧化、抗炎活性一致。

**肾功能参数。** 两种模型均显示尿素升高和肌酐降低。BBR-loaded Ag–ZnO NPs在毒性模型中最佳地恢复了血尿素水平，两种模型的肌酐改善程度相似，表明直接氧化应激损伤对抗氧化治疗响应更好。

**脂质谱。** 两种模型均出现血脂异常（TC、TG、LDL升高，HDL降低）。BBR-loaded Ag–ZnO NPs在CCl₄模型中将脂质谱恢复至接近对照水平，可能与BBR激活AMPK通路、抑制脂生成基因SREBP-1c和SCD1有关。

**血清抗氧化谱。** 两种模型的MDA升高、CAT、SOD活性和GSH水平降低。BBR-loaded Ag–ZnO NPs最有效地降低了MDA并恢复了SOD、CAT和GSH水平，T3组的恢复程度优于Y3组，因CCl₄暴露主要增加脂质过氧化和抑制内源性抗氧化防御。

**组织病理学。** CCl₄和四氧嘧啶均导致肝细胞微泡脂肪变性、肾小管肿胀和充血。BBR-loaded Ag–ZnO NPs在两种模型中都最大程度地恢复了肝脏和肾脏的正常结构（肝小叶结构完整、肾小球和肾小管正常），但CCl₄模型中的结构恢复程度更高。

### 四、讨论与结论

研究讨论了CCl₄与四氧嘧啶毒性机制的本质差异。四氧嘧啶通过选择性破坏胰腺β细胞引起持续性高血糖，进而通过AGEs积累、多元醇通路、RAAS激活和SGLT2上调等多重机制间接损害肝肾功能；而CCl₄经细胞色素P450代谢直接产生自由基，触发脂质过氧化和炎症反应，直接损伤肝肾。BBR-loaded Ag–ZnO NPs的保护机制可能包括：清除自由基以保护细胞膜完整性；通过激活AMPK/Nrf2通路上调抗氧化酶（CAT、SOD、HO-1、NQO1等）；通过AMPK介导的NF-κB抑制降低炎症反应；以及通过调节PI3K/Akt/mTOR通路诱导自噬清除受损细胞器。

研究结论指出，BBR-loaded Ag–ZnO NPs在两种模型中都展示了肝肾保护潜力，但在CCl₄诱导的直接氧化应激模型中效果更为显著。研究人员认为，该纳米制剂的疗效并非取决于模型本身而是损伤类型——其在对抗直接氧化毒性方面优于间接代谢毒性。此外，研究也指出潜在的药物动力学、毒理学和最适剂量仍需进一步探索，以确保临床转化前的安全性和长期有效性。