索拉非尼负载卟啉-磷脂脂质体用于增强肝细胞癌化学光疗的研究

《RSC Advances》：Sorafenib-loaded porphyrin-phospholipid liposomes for enhanced chemophototherapy in hepatocellular carcinomaOpen Access

　　

索拉非尼（SF）仍是治疗肝细胞癌（HCC）的一线化疗药物。然而，其临床效用受到全身毒性和快速出现的耐药性的严重制约。为克服这些挑战，研究人员开发了一种共包封SF和卟啉-磷脂偶联物（2HPoP）的脂质体纳米平台，用于化学光疗（chemophototherapy）联合治疗。合成的载SF 2HPoP脂质体（2HPoP lip@SF）表现出良好的理化特性，包括高包封效率、胶体稳定性和长期储存稳定性。在665 nm红光激光照射下，2HPoP lip@SF实现了可控的药物释放和强效的活性氧（ROS）生成，从而发挥协同抗肿瘤作用。在体外，2HPoP lip@SF联合红光激光照射显著降低了肝癌细胞的活力，在同等浓度下表现出优于游离SF的治疗效果。此外，在人HCCLM3肿瘤小鼠模型中，2HPoP lip@SF联合激光照射显示出比同等化疗和光动力单一疗法更有效的肿瘤缩小效果。总之，研究人员提出了一种简便而有效的策略，在单个脂质体系统内共递送SF和光敏剂。2HPoP lip@SF制剂不仅增强了治疗效果，而且为改善HCC治疗结局提供了一种可临床转化的方法。

肝细胞癌（hepatocellular carcinoma, HCC）预后极差，在现有治疗模式下5年总生存率仅为15%–20%。早期HCC常无症状，多数患者确诊时已处于晚期，根治性手术难以实施，因此全身化疗成为晚期HCC的主要策略。索拉非尼（sorafenib, SF）是美国FDA批准用于晚期HCC一线治疗的口服多靶点酪氨酸激酶抑制剂（tyrosine kinase inhibitor, TKI），通过抑制RAF/MEK/ERK通路直接抑制肿瘤增殖，同时阻断血管内皮生长因子受体（VEGFR）和血小板衍生生长因子受体（PDGFR）抑制血管生成。然而，SF的临床获益有限，约仅三分之一患者获得显著生存延长，原因包括耐药性快速出现、肿瘤内蓄积低、全身毒性及穿透能力差。为克服这些障碍，将化疗与光动力治疗（photodynamic therapy, PDT）相结合的化学光疗（chemophototherapy, CPT）策略应运而生。脂质体是共递送化疗药与光敏剂的理想载体，其中卟啉-磷脂偶联物（2HPoP）掺入脂质体双层后，既作为光敏剂，又可在光照下触发药物释放。基于此，研究人员开发了聚乙二醇化的2HPoP脂质体负载SF（2HPoP lip@SF），以期协同化疗与PDT提高HCC疗效。该研究首次报道了SF负载2HPoP脂质体用于HCC治疗，为改善HCC临床结局提供了可转化策略。

研究人员采用乙醇注入结合高压氮气挤出法制备脂质体。将2HPoP、二油酰磷脂酰胆碱（DOPC）、胆固醇和PEG化脂质以0.3:60:35:5摩尔比混合，与SF溶于乙醇后注入磷酸盐缓冲液（PBS），经0.4、0.2、0.1 μm聚碳酸酯膜挤出，透析去除未包封药物。通过高效液相色谱（HPLC）测定包封效率和载药量；采用动态光散射（DLS）和透射电子显微镜（TEM）表征粒径、zeta电位和形貌。药物释放实验使用透析袋法，在2 h和6 h时给予665 nm激光照射（50 mW cm^-2）。细胞摄取通过流式细胞术检测；ROS产生分别采用单线态氧传感器绿（SOSG）探针和DCFH-DA探针检测。体外细胞毒性使用CCK-8法，细胞凋亡采用Annexin V-FITC/PI双染流式分析。体内实验选用25只4周龄雌性BALB/c裸鼠，皮下接种1.5×10⁷ HCCLM3细胞建立移植瘤模型（经郑州大学第一附属医院动物护理与使用委员会批准，编号2021-KY-0634-001），设5组：PBS对照、游离SF、2HPoP lip@SF无激光、2HPoP lip+激光、2HPoP lip@SF+激光；游离SF经腹腔注射，脂质体经静脉注射，激光组在注射后1 h以150 mW cm^-2照射33 min，一周后重复治疗。

3.1 实验原理：2HPoP lip@SF经尾静脉注射后通过EPR效应富集于肿瘤组织，665 nm激光照射触发SF释放和ROS产生，实现协同化学光疗。

3.2 脂质体的制备与表征：UV-vis光谱显示2HPoP lip@SF在675 nm和420 nm处有2HPoP特征吸收，并在270 nm处出现SF吸收峰，证实成功载药。荧光光谱显示2HPoP在脂质体中发生自淬灭，加入Triton X-100后荧光增强。DLS测得2HPoP lip@SF粒径约80.58 nm，PDI为0.102，zeta电位约-2.45 mV；TEM显示典型球形结构。体外释放实验表明，无激光时12 h释放约10%，激光照射显著促进SF释放。

3.3 2HPoP lip@SF的稳定性：在4°C储存8周后SF浓度保持稳定；经665 nm激光连续照射2 h后SF化学完整性未被破坏；在50%血清中孵育后仍保留约90%的SF，表明脂质体具有良好的储存稳定性、光稳定性和血清稳定性。

3.4 体外细胞摄取与ROS产生：流式细胞术显示Hep3B和HCCLM3细胞在孵育1 h时摄取2HPoP lip@SF最多。SOSG实验表明2HPoP lip和2HPoP lip@SF在激光照射下均产生持续高效的ROS，两者无显著差异，说明SF不影响2HPoP的光敏活性。DCFH-DA探针检测证实激光照射后细胞内ROS水平显著升高。

3.5 体外细胞毒性研究：CCK-8结果显示，无激光时空白2HPoP lip对两种细胞无明显毒性；游离SF呈浓度依赖性杀伤。无激光时2HPoP lip@SF的毒性略低于游离SF，表明脂质体封装降低非特异性毒性；激光照射后2HPoP lip@SF产生最强细胞毒性，半数抑制浓度（IC₅₀）分别为0.012 mg mL^-1（Hep3B）和0.007 mg mL^-1（HCCLM3），证实化疗与PDT的协同作用。

3.6 体外细胞凋亡评估：Annexin V-FITC/PI流式分析显示，在Hep3B细胞中，2HPoP lip@SF+激光的凋亡率为16.5%，而2HPoP lip+激光组仅为2.3%；在HCCLM3细胞中，P