赖氨酸-半胱氨酸S-O-NH交联质子化态的多尺度计算研究：支持N-质子化S-O-NH2+形式的证据

《RSC Advances》：Protonation state of the S-O-NH crosslink between lysine and cysteineOpen Access

　　

一种新的假定的氧桥连赖氨酸-半胱氨酸交联在革兰氏阴性菌淋病奈瑟菌（Neisseria gonorrhoeae）的转醛醇酶（NgTAL）中被实验鉴定。该交联被认为可作为可逆氧化还原开关。尽管它通常以其中性S-O-NH形式表示，但其质子化态仍不确定。重要的是，质子化可能影响交联的物理化学性质以及周围蛋白质环境的结构。在本研究中，研究人员采用结合QM-cluster、QM/MM和分子动力学模拟的多尺度计算方法，研究了Cys38-S-O-NH-Lys8交联的优先质子化态以及氮质子化的结构后果。QM-cluster计算确定氮中心在所有考虑的介电环境中具有最高的质子亲和力（proton affinity, PA）和气相碱度（gas-phase basicity, GPB）。当显式包含结晶水分子时，通过水网络的质子转移产生了N-质子化的S-O-NH2+物种，而未获得稳定的S-或O-质子化交联。QM/MM计算也支持氮质子化，给出的PA和GPB值分别为1700.2和1685.5 kJ mol?1。此外，优化的QM/MM结构揭示了一个扩展的氢键网络，该网络通过水分子将质子化交联与Glu93连接起来。三次独立的200 ns MD模拟进一步表明，质子化交联通过与Glu93的直接氢键（约69%占有率）或单水桥连（约18%）维持持久的关联，而中性交联大多缺乏与Glu93的相互作用（约66%）。氮质子化还将Glu93侧链的优先构象转向类似于晶体结构的旋转异构状态，并适度改变了蛋白质的整体构象动力学。总的来说，这些结果一致支持将NgTAL交联主要归为N-质子化的S-O-NH2+。其稳定性源于局部水网络、Glu93和周围蛋白质环境的共同影响。

研究背景与科学问题

近年来，在革兰氏阴性菌淋病奈瑟菌（Neisseria gonorrhoeae）的转醛醇酶（NgTAL）中实验鉴定了一种全新的假定的氧桥连交联，即半胱氨酸（Cys）与赖氨酸（Lys）之间的S-O-NH交联。该交联被提出作为可逆的非金属氧化还原开关发挥作用，并且后续研究表明此类S-O-NH氧化还原开关在生命各界的蛋白质中普遍存在，甚至发现了类似的半胱氨酸-精氨酸S-O-NH交联。这促使研究人员重新评估对蛋白质架构及其生物学过程含义的理解。然而，关于该交联的确切性质，尤其是其可能的质子化状态及其对交联结构和功能的影响，尚不清楚。此前的研究通常假设该交联为中性的S-O-NH形式。但质子化是基本的生化过程，对稳定蛋白质结构、代谢反应、酶催化以及其他生物交联的功能至关重要。因此，阐明该S-O-NH交联的优先质子化态，对于理解其形成机制、生理功能及相关方面至关重要。

研究内容与核心结论

为探究NgTAL中Cys38-S-O-NH-Lys8交联的优先质子化态，研究人员采用了结合QM-cluster、QM/MM和分子动力学（MD）模拟的多尺度计算方法。研究结果一致支持该交联最可能的形式是N-质子化的S-O-NH₂⁺物种，而非传统认为的中性S-O-NH形式。这一结论得到了热力学计算、静态结构优化以及动态模拟的多重验证。该发现明确了交联的真实化学状态，为后续研究其形成机制、稳定性及生物学作用奠定了关键基础。

关键技术方法概述

本研究主要运用了三种互补的计算技术：1）小模型QM-cluster计算，用于评估不同介电环境下交联各原子位点的质子亲和力（PA）和气相碱度（GPB）；2）基于晶体结构（PDB ID: 7ODP）构建的QM/MM模型，采用电子嵌入（EE）方案，在显式蛋白质环境中计算质子化能并优化结构；3）经典分子动力学（MD）模拟，对中性交联、质子化交联及未交联体系分别进行了三次独立的200 ns模拟，以考察质子化对动态行为的影响。

研究结果分述

1. QM-cluster计算

在不含结晶水分子的QM-cluster模型中，无论气相（ε=1.0）、蛋白质环境（ε=4.0）还是水溶液（ε=78.3）中，氮中心的PA和GPB均为最高，其次是硫和氧。当显式加入三个结晶水分子后，质子通过水网络转移到氮中心，形成了稳定的N-质子化S-O-NH₂⁺物种，而未能得到稳定的S-或O-质子化结构。这表明局部水网络可为质子向交联氮的转移提供路径。

2. QM/MM计算

QM/MM计算同样显示，S和O位点的初始质子化会导致质子发生转移（如O位点质子转移至邻近的Glu93，S位点质子移向氮），无法形成稳定结构。N-质子化交联的PA和GPB值（分别为1700.2和1685.5 kJ mol^?1）远高于其他位点。优化的QM/MM结构揭示了质子化交联通过两个结晶水分子与Glu93羧酸根形成扩展的氢键网络，有效离域并稳定了正电荷。相比之下，中性S-O-NH交联形成的氢键网络较弱。

3. 分子动力学（MD）模拟

MD模拟结果显示，质子化S-O-NH₂⁺交联与Glu93之间持久地存在直接氢键（平均约69%占有率）或单水桥连（约18%）相互作用。而中性S-O-NH交联则大部分时间（约66%）不与Glu93发生任何氢键相互作用，偶尔通过双水桥连接。氮质子化还使Glu93的侧链构象从主要的gauche^?旋转异构体转变为trans旋转异构体，更接近晶体结构中的取向，从而缩短了与交联的距离，有利于氢键形成。整体蛋白质骨架RMSD分析表明，所有体系均保持稳定，但中性交联体系的平均RMSD最高（1.124±0.125 ?），质子化体系居中（1.073±0.167 ?），未交联体系最低（0.954±0.135 ?），表明交联形成和质子化均对全局构象动力学产生了一定影响。

总结与结论

本研究通过互补的QM-cluster、QM/MM和MD模拟，一致证明NgTAL中Cys38-S-O-NH-Lys8交联最可能的形式是N-质子化的S-O-NH₂⁺物种。其稳定性源于局部水网络、Glu93残基以及周围蛋白质环境的协同稳定作用。氮质子化不仅增强了交联与Glu93之间的持久相互作用，还影响了Glu93的侧链构象和蛋白质整体的构象动力学。这些发现确立了N-质子化S-O-NH₂⁺交联为NgTAL中最合理的形式，为未来研究此类交联在蛋白质中的形成、稳定性和生物学作用提供了基础。特别是，与脑膜炎奈瑟菌同源转醛醇酶（NmTAL）的比较研究，可能有助于揭示局部静电环境差异如何改变交联氮的质子化状态，进而导致两者对交联形成反应的差异。