1,2,3-三唑连接的DNA生物传感器：从分子设计到实时应用

《RSC Advances》：1,2,3-Triazole-linked DNA biosensors: molecular design to real-time applicationsOpen Access

　　

现代生活的许多方面都依赖于快速、准确和选择性的检测方法，尤其是对重金属毒素、病原体、生物分子、金属离子和miRNA的检测。因此，需要可靠且通用的先进生物传感平台来应对这些挑战。CuAAC辅助系统因其高效率、生物正交性和位点特异性偶联能力，已成为构建DNA生物传感器的有效工具。本综述重点阐述了铜(I)催化的叠氮-炔烃环加成反应（CuAAC）在DNA生物传感平台中的作用，着重强调了CuAAC辅助的1,2,3-三唑在不同连接方式、表面修饰和双链连接中的应用。此外，还讨论了点击化学与纳米材料、DNA结构、DNAzyme、CRISPR和ATRP在信号放大和高灵敏检测中的整合。文中涵盖了多种信号转导机制，包括荧光、电致化学发光和电化学信号输出。此外，本综述评估了最新的研究发现、潜在机制和当前存在的局限性，有助于更深入地理解点击化学如何重塑基于DNA的生物传感。总体而言，本工作强调了1,2,3-三唑在增强下一代生物传感器的灵敏度、选择性和实际应用性方面的强大作用。

主体内容总结

引言

现代生活对快速、选择性、现场识别多种目标物的需求推动了生物传感技术的快速发展。传统检测方法如聚合酶链式反应（PCR）、酶联免疫吸附测定（ELISA）、高效液相色谱（HPLC）、气相色谱和质谱等，虽然准确可靠，但存在设备昂贵、操作复杂、难以普及到发展中国家和偏远地区等局限性。生物传感器作为一种新兴的分析工具，通过整合生物识别元件和信号转导器，将生化反应转化为可测量的信号，具有快速、灵敏、低成本、即时检测（POCT）等优势。DNA生物传感器凭借DNA碱基互补配对规则的特异性分子识别能力，在病原体检测、基因突变和毒素分析等领域展现出独特优势。然而，传统DNA生物传感器存在DNA探针在传感器表面固定化差、信号探针附着稳定性差、探针与传感器连接随机取向且连接弱等问题，导致灵敏度、选择性和重现性受限。为克服这些瓶颈，点击化学（click chemistry）应运而生，特别是铜（I）催化的叠氮-炔环加成（CuAAC）反应，其产物1,2,3-三唑（triazole）具有优异的生物正交性、位点特异性和稳定性，为DNA探针、信号标签和识别元件在传感器表面的稳定、定向偶联提供了高效解决方案。

1,2,3-三唑在DNA生物传感器中的作用

1,2,3-三唑因其芳香稳定性、抗酶降解能力和广泛适用性，已成为DNA生物传感器构建中的关键工具。该部分主要探讨了CuAAC在表面修饰和探针连接中的应用，包括1,2,3-三唑基表面连接和双端修饰DNA链的构建。

1,2,3-三唑基表面连接

在DNA生物传感器的制备中，DNA与载体或电极表面的高效稳定偶联至关重要。传统的连接方法包括硫醇-金（Au–S）键和胺-羧基键，但这些方法分别仅适用于金电极和碳电极，存在局限性。CuAAC反应通过形成1,2,3-三唑键，提供了通用的表面连接策略，能够将两种不同纳米粒子合并为一种聚集结构。多项研究展示了该策略的应用：Chen等构建了基于聚多巴胺纳米颗粒介导点击化学的微粒计数免疫传感器，用于检测赭曲霉毒素A，检测范围为0.5–800 ng mL^?1，LOD为0.2 ng mL^?1；Lei等开发了基于CoFe₂O₄磁性纳米颗粒的电致化学发光纳米传感器，用于铜离子检测；Lupoi等利用芳基重氮盐和点击化学构建了用于双氯芬酸检测的电化学生物传感器，LOD为17.95 μM；Qiu等开发了基于点击化学辅助DNA的OTA检测传感器，通过1,2,3-三唑连接稳定DNA双链，显著降低背景信号，LOD为72 pg mL^?1。

通过1,2,3-三唑形成的双端修饰DNA链

DNA链可通过5′-端炔基和3′-端叠氮基进行双端修饰，通过CuAAC反应形成双端连接的双链DNA结构，其中包含稳定的1,2,3-三唑键。Huang等开发了双模式荧光和比色Cu2?检测传感器，通过CuAAC反应形成发卡结构，随后通过引物交换反应（PER）生成G-三链体序列，结合硫黄素T（ThT）产生荧光信号，或结合血红素形成类过氧化物酶进行比色检测，LOD分别为6.85 × 10^?2 μM和7.04 × 10^?2 μM。Zhang等开发了基于CuAAC的荧光偏振传感器用于氨苄青霉素检测，LOD为80 pg mL^?1；Zhang等还设计了基于多驱动链置换反应和点击化学的miRNA-21电化学检测方法；Li等开发了基于DNAzyme的Cu2?检测平台，通过1,2,3-三唑形成完整的Mg2?依赖DNAzyme，实现可视化检测。

点击辅助聚合用于信号探针修饰

点击聚合（click polymerization）技术通过多官能团单体的叠氮-炔基端基之间的重复分子间偶联，实现信号探针的高效信号放大。Zhu等构建了基于点击聚合的电化学生物传感器，用于人血清中外泌体的检测，通过CuAAC反应合成电活性聚合物P（DES-BFPA）进行信号放大。Cheng等利用点击聚合反应合成P（DEB-DSDA）聚合物，用于人T淋巴细胞病毒II型的电化学检测。Liu等构建了基于点击聚合的Aflatoxin B₁（AFB₁）检测传感器，检测范围为2 fg mL^?1至2 ng mL^?1，LOD为0.804 fg mL^?1。Wen等组装了基于DNA点击聚合的荧光传感器用于IFN-γ检测，LOD为1.75 fM。

信号转导策略

信号转导是生物传感器的核心组件，将目标识别转化为可测量的信号输出。1,2,3-三唑基DNA生物传感器通过CuAAC提供的位点特异性偶联能力，增强了信号转导效率，支持荧光、电化学、电化学发光和表面增强拉曼散射等多种信号输出模式。

荧光信号转导

荧光信号转导具有响应快、灵敏度高的优点。1,2,3-三唑可实现荧光团和猝灭剂的位点特异性偶联。Wang等开发了基于CLICK-17 DNAzyme催化的双信号生物传感器，用于副溶血性弧菌检测，LOD为6 CFU mL^?1；Zhou等利用CuAAC反应生成香豆素-1,2,3-三唑荧光信号，用于荧光假单胞菌检测；Xiong团队构建了基于点击辅助多荧光团核酸探针的单分子生物传感器，用于汉坦病毒检测，回收率92.91%–103.66%；Hang等开发了基于Phage@DNAzyme探针的荧光点击化学检测方法，用于食品中大肠杆菌O157:H7检测，回收率91–110%。

电化学信号转导

电化学生物传感器具有能耗低、成本低、灵敏度高的优点。1,2,3-三唑用于电极表面稳定DNA探针或氧化还原活性分子的固定化。Zhou等构建了基于点击化学介导的酶辅助miRNA141检测电化学传感器，LOD为7.78 × 10^?9 μM；Zhou等还开发了基于CuAAC的E. coli电化学检测传感器，LOQ为1 CFU mL^?1；Liu等构建了基于SPAAC反应的全血样本CA72-4检测传感器；Yu等开发了基于可见/近红外诱导的RAFT聚合的miRNA-21检测平台。

表面增强拉曼散射（SERS）信号转导

SERS技术通过金属纳米结构的表面增强效应放大弱拉曼信号，具有高灵敏度和多重检测潜力。Zhang等构建了基于SERS和电化学发光（ECL）的双模式生物传感器，用于miRNA-133a检测，LOD分别为3.2 × 10^?11 μM（ECL）和1.7 × 10^?10 μM（SERS）；Hu等构建了基于点击化学的无酶SERS传感器用于p53基因检测，LOD为1.74 × 10^?8 μM。

电化学发光（ECL）信号转导

ECL生物传感器通过电化学反应产生光信号，具有低背景干扰和高灵敏度。Huang等构建了基于点击化学诱导的杂交链式反应（HCR）的ECL传感器用于碱性磷酸酶检测，LOD为0.7 mU L^?1；Huang等构建了用于焦磷酸酶检测的ECL传感器，LOD为8 mU；Liu等开发了基于CuO介导点击反应的ECL传感器用于miRNA-21检测，LOD为2.6 × 10^?10 μM。

信号放大策略

信号放大策略通过将单次目标识别事件转化为多次信号放大事件，显著提高检测灵敏度。1,2,3-三唑可与多种放大技术结合，包括G-四链体（G-quadruplex）、CRISPR、原子转移自由基聚合（ATRP）、纳米材料辅助和DNA结构辅助放大。

基于1,2,3-三唑的G-四链体信号放大

G-四链体由富含鸟嘌呤的DNA链组成，具有高稳定性，可结合血红素形成类过氧化物酶，产生比色信号。Wang等利用核酸模板化点击连接线性扩增反应（NA-CLLAR）和指数扩增反应（NA-CLEAR）结合G-四链体/ThT复合物，实现高灵敏荧光检测；Peng等开发了基于点击化学的Pb2?检测传感器，通过G-四链体形成和光诱导电子转移（PET）实现信号检测，LOD为1.245 × 10^?2 μM；Ren团队设计了基于G-四链体/血红素复合物的比色免疫检测方法用于AFB₁检测。