逍遥散通过调控EZH2恢复肝纤维化中NK细胞的抗纤维化活性

《Phytomedicine》：Xiaoyao San restores NK cell anti-fibrotic activity through regulation of EZH2 in liver fibrosis

　　

摘要

背景：肝纤维化是全球重大的健康问题，目前有效的治疗方法有限。自然杀伤（NK）细胞能够通过其激活受体，如自然杀伤细胞群2成员D（NKG2D）和自然杀伤p46，靶向活化的肝星状细胞（HSCs）。然而，纤维化环境往往限制了其对抗纤维化的有效性。虽然增强子抑制子同源物2（EZH2）在HSCs活化和NK细胞调节方面的功能已被确立，但其对NK细胞介导的抗纤维化活动的影响，以及传统中药逍遥散（XYS）抗纤维化特性的机制仍有待进一步阐明。

目的：本研究旨在探讨EZH2是否通过减少NK细胞数量、成熟度和活化水平来抑制NK细胞的抗纤维化功能，并评估XYS是否通过抑制EZH2恢复NK细胞介导的活化HSCs清除作用。

方法：我们建立了四氯化碳诱导的小鼠肝纤维化模型，其中包含NK细胞特异性条件性敲除Ezh2的小鼠以及肝细胞特异性过表达Ezh2的小鼠，并分别加入XYS干预。利用LX-2细胞和NK92MI细胞进行体外共培养实验，以分析XYS对EZH2表达和NK细胞细胞毒性的直接影响。通过组织学、血清生化学和Western blot检测肝纤维化。通过流式细胞术检测NK细胞数量、成熟度和NKG2D表达。进行全转录组测序和单细胞RNA测序以表征转录组改变。

结果：NK细胞特异性敲除Ezh2减轻了四氯化碳诱导的纤维化，增加了肝内NK细胞比例及成熟CD11b?NK亚群数量，并改变了NK细胞效应基因表达。相反，肝细胞特异性过表达Ezh2加剧了纤维化，减少了NK细胞数量，损害了成熟度，并抑制了NKG2D表达。XYS处理部分逆转了这些效应，降低了EZH2和纤维化标志物表达，并增强了NK92MI细胞对LX-2细胞的细胞毒性。

结论：EZH2作为肝纤维化中NK细胞抗纤维化活动的内在抑制因子发挥作用。XYS通过抑制EZH2恢复NK细胞功能，为其在慢性肝纤维化治疗中的应用提供了机制基础。

引言

肝纤维化是一种由慢性肝损伤后组织修复失调引起的动态且可逆的病理状态。其可逆性为预防向肝硬化和肝细胞癌演变提供了关键转折点（Papagiouvanni等，2023；Xiao等，2025）。纤维化的关键事件是肝星状细胞（HSCs）的活化（Reeves和Friedman，2002）。最近的单细胞转录组研究揭示了HSC群体的显著异质性及其在肝纤维化中的动态作用（Kisseleva等，2025；Tang等，2026）。HSCs一旦被活化，便发生转分化为肌成纤维细胞，导致分泌过量的细胞外基质成分，从而破坏正常的肝脏结构和功能（Kisseleva和Brenner，2021）。尽管越来越多的证据表明肝纤维化具有可逆性（Yan等，2025），但对抗纤维化的有效药物疗法仍然有限（Wang等，2022）。

免疫监控系统对纤维化的消退至关重要。自然杀伤（NK）细胞通过其激活受体，包括自然杀伤细胞群2成员D（NKG2D）和自然杀伤p46，识别并清除活化的HSCs，有效减缓纤维化进程（Lee等，2015；Radaeva等，2006）。增强自然杀伤p46/NKG2D的共刺激信号或减轻TGF-β引起的免疫抑制可以恢复NK细胞的抗纤维化功能（Fuertes等，2021）。然而，在纤维化肝脏微环境中，NK细胞活性往往下降，调控这种抑制的机制尚未完全阐明（Li等，2016；Martin等，2025）。

增强子抑制子同源物2（EZH2）是一种组蛋白甲基转移酶，催化组蛋白H3第27位赖氨酸的三甲基化并介导基因沉默，已成为癌症和自身免疫疾病等多种病理条件下的关键表观遗传调控因子（Abed等，2026；Bae等，2015；Mandal等，2011）。在肝纤维化中，EZH2已被证实通过表观遗传抑制关键抗纤维化基因（包括PPARγ和KLF14）来促进HSCs活化和纤维化（Du等，2021）。EZH2的药理抑制在实验性纤维化模型中已显示出治疗潜力（Miao等，2025；Shi等，2019）。除了在HSCs中的作用，EZH2还参与调控NK细胞的发育和功能。敲除EZH2可促进NK细胞成熟并增强其抗肿瘤活性（Yu等，2021）；相反，抑制EZH2酶活性可上调NKG2D表达并增强NK细胞对肝细胞癌细胞的细胞毒性（Bugide等，2018）。尽管有这些发现，EZH2是否以及在何种程度上调控NK细胞介导的抗纤维化反应在肝纤维化中的情况仍主要未受探索。虽然EZH2抑制剂3-去氮环孢菌素A已被报道可抑制原代肝星状细胞的活化和增殖（Li等，2023），但其临床应用受到显著毒性和脱靶效应的限制（Jin等，2025；Sun等，2015），这使其使用仅限于临床前阶段并需要进一步优化。因此，迫切需要开发兼具高选择性、低毒性和强效抗纤维化作用的EZH2抑制剂（Jin等，2025）。传统中药方剂具有多成分、多靶点的特性，是天然EZH2调节剂的宝贵来源。鉴于其协调免疫反应的能力，中药方剂可能通过抑制EZH2发挥抗纤维化作用，从而恢复NK细胞对活化HSCs的识别和清除（Ye等，2025；Yuan等，2024）。这一思路促使我们研究逍遥散（XYS）——一种推荐用于肝纤维化的经典中药方剂——作为潜在的EZH2靶向药物，其可能恢复NK细胞的抗纤维化活性。

XYS是一种记载于《太平惠民和剂局方》中的经典中药方剂，被2019年版《中西医结合诊疗指南》正式推荐用于肝纤维化管理（Xu和Liu，2020）。我们课题组此前已对相关动物模型进行了XYS的剂量-反应药动力学研究并确定了最佳治疗剂量（Lu等，2022）。在本研究中，因此选择临床等效剂量用于机制研究。然而，其抗纤维化作用的精确机制仍有待完全阐明。

在本研究中，我们建立了NK细胞特异性Ezh2条件性敲除和肝细胞特异性Ezh2过表达模型，在四氯化碳（CCl?）诱导的纤维化小鼠中进行，并辅以XYS干预。此外，我们还利用人肝星状细胞LX-2细胞和NK92MI细胞进行体外共培养实验，探讨XYS对EZH2表达和NK细胞细胞毒活性的直接影响。通过整合流式细胞术、单细胞RNA测序、全转录组测序和功能分析等方法，我们对EZH2与NK细胞之间的调控关系进行了全面研究。此外，我们评估了XYS是否能通过调控EZH2增强NK细胞的抗纤维化活性。我们的结果提供了支持XYS治疗慢性肝纤维化治疗潜力的实验证据，并为驱动纤维化消退的表观遗传和免疫相互作用提供了机制见解。

章节片段

逍遥散煎剂的制备

XYS的组成列于表1。中药原料来源于上海中医药大学附属曙光医院（上海，中国）。原料以1:10（w/v）的比例浸入蒸馏水中，浸泡30分钟。随后，混合物用大火加热至沸腾，再小火慢炖30分钟。滤过第一次煎液后，残留药渣再进行……

XYX的化学表征和定量

XYS中三种标志化合物的UPLC-MS/MS测定参数列于表2。XYS煎剂的总离子色谱图见图1A；混合对照品和XYS煎剂中三种标志物的代表性MRM色谱图分别见图1B和1C。黄芩素、木犀草素和汉黄芩素A的保留时间分别约为2.52、4.04和4.34分钟，其身份通过与保留时间比较得到确认……

讨论

本研究发现，EZH2通过减少NK细胞数量、损害其发育和下调表面激活受体水平来削弱NK细胞在肝纤维化中的抗纤维化作用。相反，XYS通过抑制EZH2增强NK细胞的抗纤维化效力。这些结果确定EZH2是肝纤维化中NK细胞功能的关键抑制因子，并阐明了XYS对该疾病治疗作用的机制。

越来越多的关注被付与……

结论

在本研究中，我们证明EZH2在肝纤维化中作为NK细胞抗纤维化活性的内在抑制因子发挥作用，通过减少NK细胞数量、损害成熟度和下调NKG2D表达。NK细胞特异性Ezh2敲除减轻了CCl?诱导的纤维化，而肝细胞特异性Ezh2过表达加剧了纤维化。重要的是，XYS逆转了EZH2介导的NK细胞抑制并恢复了NK细胞对活化HSCs的细胞毒性。这些发现确定了EZH2-NK……

作者贡献声明

Qingqing Chen：撰写-原始草稿；方法论；调查；验证；数据管理。
Jia Wang：撰写-原始草稿；方法论；验证；可视化；数据管理。
Dong Guo：撰写-原始草稿；方法论；形式分析；可视化；数据管理。
Fang Kou：形式分析；验证；数据管理。
Hong Cai：形式分析；资金获取。
Guangyong Zheng：撰写-审阅与编辑；资源；数据管理；软件；监督。
Yiyu Lu：撰写-……

利益冲突声明

作者声明他们没有相关的财务或非财务利益需要披露。

致谢

本研究由国家自然科学基金（82274183，81503478）；上海市科学技术委员会科技创新计划（编号：20ZR1453700）；厦门市卫健委中医药发展专项基金（XWZY-2023-0615）资助。

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