《Polymer Testing》：A Dual-Enzymatic Cross-linked Adhesive and Self-Contraction Hyaluronic Acid Hydrogel Laden with Adipose-Derived Stem Cells to Enhance Regeneration of Full-Thickness Wound Defect
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研究人员开发了一种经葡萄糖氧化酶/辣根过氧化物酶（GOx/HRP）交联的醛基与酪胺双修饰透明质酸（HAA-Tyr）水凝胶体系，该体系具有稳健的温度无关抗溶胀性能和自收缩能力。伴随优异的自收缩特性，HAA-Tyr水凝胶展现出良好的细胞相容性，能够实现干细胞的封装
研究人员开发了一种经葡萄糖氧化酶/辣根过氧化物酶（GOx/HRP）交联的醛基与酪胺双修饰透明质酸（HAA-Tyr）水凝胶体系，该体系具有稳健的温度无关抗溶胀性能和自收缩能力。伴随优异的自收缩特性，HAA-Tyr水凝胶展现出良好的细胞相容性，能够实现干细胞的封装与递送。通过整合HAA-Tyr的力学—生物学线索与脂肪间充质干细胞（ADSCs）的功能，ADSC@HAA-Tyr创面敷料在引导全层皮肤再生方面表现出增强的性能。
皮肤是人体最大的器官，在抵御外界损伤和维持机体内环境稳定中发挥关键作用。皮肤损伤是最常见的疾病类型之一，急性创面通常可经程序化生物学过程按预期愈合，而糖尿病创面、感染创面等慢性损伤则呈现延迟甚至不愈合的特征，常伴有增生性瘢痕和瘢痕疙瘩，给患者带来沉重护理负担和经济压力。目前手术缝合、水凝胶敷料、水胶体、生长因子等策略主要通过促进渗液吸收、免疫调控和抗菌等生化功能发挥作用，但多数仍局限于创面管理的生化层面。近年研究证实适当的收缩力有利于创面愈合，具有收缩功能的创面敷料因此受到关注。传统N-异丙基丙烯酰胺（NIPAM）基热敏收缩水凝胶依赖接近体温的相变，需额外交联，且疗效对温度敏感。基于辣根过氧化物酶（HRP）催化酪胺修饰聚合物的水凝胶虽可自主收缩，却缺乏组织粘附，难以实现牵引力传递。同时，基于脂肪间充质干细胞（ADSCs）的疗法虽具有旁分泌、免疫调节和多向分化潜能，但静脉或局部注射存在细胞滞留率低的问题。因此，研发兼具自收缩、组织粘附及干细胞递送功能的新型创面敷料具有重要临床意义。
针对上述问题，研究人员构建了一种由葡萄糖氧化酶（GOx）/HRP/葡萄糖级联酶促反应交联的醛基和酪胺双修饰透明质酸（HAA-Tyr）水凝胶体系，并负载ADSCs制得ADSCs@HAA-Tyr敷料，以期通过自收缩力学线索与ADSCs旁分泌效应的协同，促进全层皮肤缺损修复。体内外实验系统验证了该敷料在收缩性能、粘附性能、生物相容性和促血管生成方面的优势，并在小鼠全层皮肤缺损模型中证实了其加速创面愈合的作用。
研究人员采用DMTMM作为偶联剂，先将酪胺接枝至透明质酸骨架合成HA-Tyr，再引入缩醛基中间体并经酸水解生成醛基修饰的HAA-Tyr，通过1H NMR和紫外分光光度法确认酪胺与醛基取代度。利用GOx/HRP/葡萄糖双酶体系实现温和原位凝胶化，避免外源H2O2添加。细胞实验采用流式细胞术鉴定人源与鼠源ADSCs表面标志物，以活/死染色和EdU实验评估细胞活力与增殖；利用扫描电子显微镜（SEM）观察水凝胶内部形貌与孔径；通过溶胀率、搭接剪切实验、万能测试机分别评价自收缩、组织粘附与力学强度；采用管形成实验和细胞划痕实验评价促血管生成能力。体内研究使用C57BL/6小鼠（雄性，6–8周龄，20–30 g）建立直径10 mm的全层皮肤缺损模型，随机分为PBS、HAA-Tyr、ADSCs悬液和ADSCs@HAA-Tyr四组（n=4），通过创面面积动态记录、H&E染色、Masson三色染色及IL-6、CD31、F4/80、CD206免疫荧光染色进行组织学评估。
合成与凝胶化研究中，酪胺取代度随投料比提高由约1.5%增至7%，醛基取代度可从38.7%调至85.4%。HRP或GOx浓度增加可显著缩短凝胶化时间，高酪胺取代度亦加速凝胶化，表明可用的酪胺基团对交联反应至关重要。细胞封装性能研究显示，GOx/HRP浓度直接影响ADSCs存活率，过高浓度导致H2O2积累并产生细胞毒性；优化后（GOx 0.2 U/mL、HRP 0.5 U/mL）封装细胞培养7天存活率仍高于80%，证明该体系具备长期细胞相容性。自收缩性能评估发现，HAA-Tyr水凝胶在4 ℃、25 ℃、37 ℃下均表现温度无关抗溶胀行为，48小时内完成70%–80%收缩，孔径随时间逐步减小，有利于早期创面闭合；pH 6.0条件下溶胀率显著升高，归因于酸性环境加速希夫碱水解，但各pH条件下仍满足使用需求。醛基修饰明显增强抗溶胀能力，提示收缩是酪胺疏水作用与醛基动态键协同的结果。组织粘附与力学表征显示，醛基含量增加使粘附强度由约20 kPa提高至约70 kPa，水凝胶对皮肤、肺、肝、心等组织均具良好粘附性；溶血率低于5%金标准；压缩强度随酪胺取代度和培养时间增加而提高，对应持续自收缩行为。体外血管生成实验中，hADSCs@HAA-Tyr显著促进人脐静脉内皮细胞（HUVECs）的管形成与迁移，表明ADSCs旁分泌功能得以保留并发挥促血管生成活性。体内伤口愈合评估中，ADSCs@HAA-Tyr组在第3天和第7天创面闭合率显著高于对照组，第14天观察到更致密的胶原沉积和毛囊新生；H&E染色显示ADSCs@HAA-Tyr组肉芽组织厚度更接近正常结构、表皮间隙更小。免疫荧光分析表明，ADSCs@HAA-Tyr组第3天和7天白细胞介素-6（IL-6）水平显著降低，F4/80阳性巨噬细胞中CD206表达升高，提示巨噬细胞向M2抗炎表型极化；CD31在第7天显著高于对照组，提示血管生成加速。
讨论部分指出，HAA-Tyr水凝胶区别于以往自主收缩敷料的优势在于温度无关收缩与温和酶促交联条件，具有更好的临床转化前景；ADSCs的引入通过免疫调节和旁分泌效应进一步放大了水凝胶的促愈合功能。研究结论认为，自主收缩、活性粘附且负载干细胞的创面敷料为慢性创面管理提供了有前景的治疗策略，也为整合细胞生物活性与力学线索的先进组织再生敷料设计提供了新思路。
