EB病毒来源细胞外囊泡在免疫学与发病机制中的作用及其诊断治疗潜力

《Canadian Journal of Infectious Diseases and Medical Microbiology》：The Role of Extracellular Vesicles in Epstein–Barr Virus Immunology and Pathogenesis for Possible Diagnostic and Therapeutic Direction

　　

EB病毒（Epstein–Barr virus，EBV）作为疱疹病毒家族成员，在全球范围内极为普遍。EBV是一种双链DNA病毒，与多种恶性肿瘤、自身免疫性疾病和淋巴瘤相关。其传播途径包括唾液和器官移植等。EBV能够产生并分泌囊泡，这些囊泡在细胞内通讯中至关重要，并且可作为体液中有价值的生物标志物用于诊断潜在疾病。此外，它们还可应用于靶向治疗。外泌体（exosomes）是一类细胞外囊泡（extracellular vesicles，EVs），在多个生物学过程中发挥重要作用。EBV相关外泌体中的一些重要组分可成为有价值的生物标志物，包括潜伏膜蛋白1（latent membrane protein 1，LMP1）和LMP2A等蛋白质、微RNA（microRNAs，miRNAs）以及长链非编码RNA（long noncoding RNAs，lncRNAs）。本综述探讨了EBV来源外泌体的诊断和治疗潜力，同时指出了其面临的挑战，包括缺乏标准化、外泌体分离困难以及提高基于外泌体的疗法效率等问题。

论文主体内容总结

1. 引言

EBV属于疱疹病毒家族，全球约90%成人曾感染。EBV为双链线性DNA病毒，可引起B细胞淋巴瘤。病毒存在潜伏期和裂解期两个主要阶段：潜伏期复制不活跃，仅表达维持病毒休眠状态所需的限制性基因，包括EBV核抗原（EBNA1、2、3A、3B、3C及EBNA前导蛋白[EBNA-LP]）、潜伏膜蛋白（LMP1和LMP2）、EBV编码的小RNA（EBER1和EBER2）及miRNA；裂解期则发生活跃复制，产生感染性病毒颗粒，并可通过调控细胞过程促进肿瘤发生。除B细胞淋巴瘤外，EBV还与鼻咽癌（nasopharyngeal carcinoma，NPC）、胃癌、噬血细胞综合征等多种恶性及非侵袭性疾病相关。在疟疾流行区常见的伯基特淋巴瘤（Burkitt’s lymphoma，BL）也是EBV感染的结果。EBV还可通过器官移植传播，在免疫功能低下患者中导致移植后淋巴增殖性疾病（post-transplant lymphoproliferative disorder，PTLD）。此外，EBV是诱导免疫耐受的重要触发因素，与皮肌炎、系统性红斑狼疮（systemic lupus erythematosus，SLE）和类风湿关节炎等自身免疫性疾病相关。

EVs是大小为20-1000 nm的脂双层结构，包括微囊泡、凋亡小体以及最重要的外泌体。外泌体携带核酸、蛋白质和脂质等多种分子，其运输功能使其能够执行清除细胞废物、保护内容物免于降解以及通过传递关键分子维持稳态等重要功能。多囊泡体（multivesicular bodies，MVBs）包含外泌体，在与质膜融合时将其释放到细胞外空间。外泌体被认为是细胞间通讯的关键调节因子，参与免疫应答、再生等生理过程以及心血管疾病、炎症等病理过程，还可通过抑制凋亡、增强血管生成和产生化疗耐药性等方式促进肿瘤发展。

EBV产生多种分子（包括蛋白质、核酸和miRNA），这些分子在外泌体中的存在促进了它们的融合、细胞间通讯和致病功能。含LMP1的外泌体可抑制T细胞增殖和肿瘤细胞逃避免疫系统；LMP2A可激活致癌信号通路NF-^κB。EBV编码的miRNA在调节宿主和病毒基因表达中发挥重要作用，某些miRNA（尤其是BART家族）在EBV来源外泌体中高表达。EBV感染细胞释放的EVs含有许多重要组分，可刺激IL-4、IL-6、IL-8和IL-13等多种细胞因子和趋化因子的表达，从而导致疾病发展和肿瘤微环境形成。

外泌体的生物发生始于货物内吞和早期内体形成，后者可成熟为晚期内体或MVBs。随后，货物被分选进入腔内囊泡（intraluminal vesicles，ILVs），MVB膜与质膜融合并将ILVs释放到细胞外。EVs释放后可对邻近细胞产生内化、配体-受体相互作用和膜融合等不同类型的影响。

2. EBV来源外泌体的生物发生与组成

2.1 劫持宿主外泌体通路

在EBV感染的细胞中，病毒可劫持宿主的内体系统和代谢途径进行自身组装，改变EVs的内容物将病毒因子转移到未感染细胞，从而促进病毒传播和疾病进展。EBV通过将LMP1等病毒组分分泌到宿主细胞的EVs中来调控细胞间信号传导。LMP1整合入外泌体与分泌囊泡致癌潜力的增加相关。此外，PI3-K/Akt、Wnt/^β-catenin、NF-^κB和JAK/STAT等关键信号通路可被LMP1利用以驱动EBV相关疾病进展和肿瘤发展。来自EBV感染细胞的外泌体被发现可输出调节免疫反应的宿主蛋白，这可能是病毒逃避免疫系统的策略。含FasL的外泌体可通过激活涉及caspase-3、7和8的外源性凋亡途径诱导受体细胞凋亡。另一方面，EBV⁺ B细胞释放的外泌体可通过刺激STAT3磷酸化导致皮肤T细胞淋巴瘤（cutaneous T-cell lymphoma，CTCL）细胞中白细胞介素-10（IL-10）和程序性死亡配体1（programmed death-ligand 1，PD-L1）表达增加，这可能有助于T/NK细胞淋巴增殖性疾病中的免疫逃逸机制。

2.2 EBV来源外泌体的分子货物

EBV产生的多种分子（如蛋白质和核酸）被整合入外泌体，促进细胞间通讯并保护其免受降解。LMP1作为EBV的重要癌蛋白，被整合入外泌体膜，含LMP1的外泌体可抑制T细胞。在核酸方面，EBV持有编码超过80种蛋白质的线性双链DNA，并表达EBER1、EBER2和miRNA。病毒miRNA可调节病毒转录本和宿主基因网络，从而促进病毒的感染周期，并导致疾病发展和癌症转移。BART区域包含22个miRNA前体（BART1至BART22），产生44个成熟miRNA。miR-BARTs已在EBV感染上皮细胞分泌的外泌体中检测到，可促进感染细胞生长并传播感染，在转移和增殖中发挥关键作用。例如，miR-BART1-3p可通过外泌体途径促进胃癌进展。除上述病毒组分外，EBV还具有EBNA1、2、3A、3B、3C和EBNA-LP。EBNA1促进LMP1表达，EBNA2和EBNA-LP分别导致B细胞和幼稚B细胞的存活，EBNA3则通过抑制CDKN2B转录导致细胞增殖。

病毒miRNA和蛋白质从EBV感染细胞分泌的外泌体中释放，刺激靶细胞表达细胞因子和趋化因子，使微环境向有利于病毒的方向改变。IL-4、IL-6、IL-8、IL-13、CXCL10和CXCL12等在EBV相关肿瘤中过表达并导致疾病发展。EBV可降低干扰素信号传导，IFI16和裂解的IL-1^β有助于宿主免疫逃逸。为维持EBV相关恶性肿瘤中的免疫抑制微环境，IL-10下调HLA I类和II类抗原表达并抑制CD8⁺ T细胞毒性。LMP1和EBNA1增强免疫抑制介质的表达。

2.3 研究EBV来源外泌体的技术

基于离心的方法被认为是最有效的外泌体分离方法，超速离心因其快速可靠而被广泛使用。流式细胞术是另一种已知的EVs快速分析和测量技术。纳米级流式细胞术和nanoFACS可用于区分病毒与EVs。高通量RNA-Seq结合RT-qPCR用于分析EVs的RNA含量。

3. EVs和外泌体在EBV免疫生物学中的作用

3.1 免疫逃逸

EBV修饰的外泌体通过携带病毒蛋白和RNA在受体细胞中启动信号级联反应。EBV阳性细胞分泌含LMP1的外泌体，通过抑制单核细胞和T细胞的增殖使肿瘤细胞逃避免疫系统，这些外泌体在受体细胞中启动PI3K/AKT和MAPK/ERK通路。LMP1还通过阻止B细胞分化为抗体分泌细胞来抑制免疫反应。LMP2可激活NF-^κB致癌信号通路。EBV miRNA由于抑制CD4⁺ T细胞分化而导致细胞毒性EBV特异性CD4⁺效应T细胞活化减少，并阻止EBV抗原与MHC II结合。BART miRNA在EBV阳性淋巴瘤细胞中调节TNF-^α、IL-10和ARG1表达水平。在EBV阳性鼻咽细胞中，EBV miR-BART22抑制LMP2A表达使其不被CD4⁺和CD8⁺ T细胞识别。

3.2 病毒持续存在与潜伏

EBV外泌体含有miRNA，可调控EBV生命周期中潜伏期和裂解期之间的转换，通过靶向宿主和病毒mRNA发挥作用。LMP1可通过NF-^κB信号通路抑制裂解期的起始来加强潜伏期。

3.3 细胞间通讯

EBV感染NPC细胞释放的外泌体可刺激未感染细胞中的生长信号通路，LMP1和病毒miRNA被运送到未感染细胞，miRNA选择性抑制其人类miRNA靶点。EBV外泌体携带的miRNA影响靶细胞中的线粒体呼吸，从而改变肿瘤微环境中的代谢。EBV外泌体可将LMP1等病毒组分递送至肿瘤微环境，增强邻近细胞中的促癌信号。

4. EBV来源外泌体在疾病中的致病作用

4.1 EBV相关癌症

在NPC中，EBV感染通过激活p62-Keap1-NRF2信号通路降低NPC细胞对铁死亡的敏感性。EBV编码的44种miRNA可通过外泌体转移到受体细胞。miR-BART11和miR-BART17分别靶向FOXP1和PBRM1，抑制PD-L1表达，导致PD-L1过表达和肿瘤免疫逃逸。BART13-3p通过下调肿瘤抑制因子AB12诱导上皮-间充质转化促进转移。EBV miR-BART10-5p通过增加VEGF表达和限制Spry3促进血管生成。在霍奇金淋巴瘤中发现miR-BARTs 19-3p和13-3p，NK/T细胞淋巴瘤中存在高水平BART19-3p。BART Cluster 2区域对淋巴增殖性疾病形成有重要贡献。

LMP1通过与Hrs和Syntenin-1相互作用被引导进入EVs进行包装和释放，含LMP1的外泌体具有免疫抑制功能。EBNA1刺激脱髓鞘导致多发性硬化（multiple sclerosis，MS）恶化。在EBV相关胃癌（EBVaGC）中，感染EBV的胃上皮细胞发生克隆性生长，CpG岛DNA甲基化出现在多个癌症相关基因启动子区域。

含LMP1的外泌体与受体细胞融合后对NK细胞产生免疫抑制效应，通过诱导LMP1阴性细胞中IL-8的转录促进其增殖，并导致与转移高度相关的上皮-间充质转化。EBV潜伏感染与调节性表观基因组重编程相关，导致免疫抑制。

4.2 自身免疫性疾病

MS与EBV感染相关，患者在神经系统症状出现前即表现出针对EBNA1的抗体水平升高。EBV外泌体刺激APCs中的促炎反应。炎症可激活淋巴组织中的EBV感染B细胞，诱导细胞因子和EBERs释放，通过外泌体分泌导致血脑屏障完整性受损和神经元损伤。EBNA1与中枢神经系统蛋白GlialCAM1之间存在分子模拟，该蛋白存在于慢性活动性MS斑块中。在SLE中，EBNA1与细胞Ro 60之间存在分子模拟，可能诱导自身免疫反应。

5. EBV来源外泌体的诊断和治疗潜力

EBV外泌体在不同体液中的存在表明其作为非侵入性生物标志物的潜在用途。LMP1、LMP2A和EBER是EBV相关癌细胞中表达的最重要蛋白质。含LMP1的外泌体可通过激活NF-^κB/PI3等信号通路触发肿瘤生长，抑制T细胞活化和增殖。亲环蛋白A（Cyclophilin A，CYPA）在NPC外泌体中过表达并与LMP1水平正相关。EBERs与狼疮抗原（La）核糖核蛋白复合物可增加外泌体稳定性。高水平的EBV miR-BART1和miR-BART4在胃癌中被观察到。在NPC患者中检测到LncRNA PVT1和miRNA-155的高表达。

在治疗方面，阻断含半乳糖凝集素-9的外泌体可修复宿主免疫系统。工程化外泌体如载有antagomiR-BART-5p的iRGD标记外泌体可靶向EBV编码的miR-BART-5p。含V^δ2-T细胞的外泌体通过FasL/TRAIL途径诱导细胞死亡并直接杀死EBV相关肿瘤。抑制LMP1等EBV编码分子整合入外泌体或其后续释放可减轻免疫逃逸并阻碍肿瘤进展。

6. 挑战与未来方向

EBV外泌体研究的主要挑战包括患者样本中生物标志物检测灵敏度低、候选标志物（如LMP1和BART miRNAs）的特异性存疑、不同分离方法缺乏标准化、难以从正常外泌体和其他EVs中区分EBV外泌体。为解决当前挑战，研究需聚焦于数字PCR和单个外泌体分析等高灵敏度分子方法。外泌体修饰（如装载miRNA）已成为癌症治疗的新策略，靶向EBV⁺外泌体以及防止EBV编码分子包装入外泌体是新兴的治疗方法。

7. 结论

EBV相关外泌体携带多样的病毒miRNA和蛋白质货物，影响免疫反应并促进肿瘤进展，使其在非侵入性诊断和靶向治疗方面具有前景。诊断方面迫切需要标准化的外泌体分离方案以及确认LMP1和BART miRNAs等生物标志物可靠性的研究。治疗方面的优先事项包括使用工程化外泌体作为药物递送载体、防止病毒组分包装入外泌体以及在动物模型中测试外泌体疫苗。深入理解控制货物选择性装载、细胞间通讯以及外泌体与受体细胞相互作用的分子机制对于确定新的治疗靶点至关重要。