硒化紫花地丁多糖酵母微囊对雏鸡鼠伤寒沙门氏菌感染的保护效应研究

《Poultry Science》：Protective Effects of Selenium-Modified Viola philippica Polysaccharide-Loaded Yeast Microcapsules Against Salmonella Typhimurium Infection in Chicks

　　

本研究旨在探究硒化紫花地丁多糖酵母微囊（selenium-modified *Viola philippica* polysaccharide-loaded yeast microcapsules，SVPP@YM）对雏鸡鼠伤寒沙门氏菌（*Salmonella* Typhimurium，ST）感染的保护作用。通过扫描电子显微镜（SEM）、透射电子显微镜（TEM）、粒径分析、Zeta电位测量及傅里叶变换红外光谱（FT-IR）确认了SVPP被成功包封于酵母微囊中，其包封率与载药量分别为46.50 ± 2.80%和30.07 ± 1.71%。体外实验显示，在3.125～12.5 μg/mL浓度范围内，SVPP@YM对HD11细胞无显著细胞毒性，且其细胞摄取效率高于游离SVPP。SVPP@YM可有效降低脂多糖（LPS）刺激的HD11细胞中一氧化氮（NO）、活性氧（ROS）和丙二醛（MDA）水平，下调炎症介质表达，并增强谷胱甘肽过氧化物酶（GSH-Px）活性和超氧化物歧化酶（SOD）表达。体内实验中，SVPP@YM缓解了ST感染引起的临床症状，改善了体重和免疫器官指数，维持了空肠形态，增强了紧密连接蛋白ZO-1表达及紧密连接相关基因表达，提高了分泌型免疫球蛋白A（sIgA）含量，并减轻了肠道炎症和氧化应激反应。此外，SVPP@YM通过增加微生物多样性、富集有益菌和减少致病菌重塑了肠道菌群组成。Spearman相关性分析进一步显示，*Escherichia-Shigella*丰度与肠道屏障功能、黏膜免疫和抗氧化能力相关参数呈负相关，而与MDA、IL-1β和TNF-α呈正相关。综上所述，这些发现表明SVPP@YM能有效保护雏鸡免受ST诱导的损伤，并可能作为家禽ST感染的一种天然干预策略。

鼠伤寒沙门氏菌（*Salmonella* Typhimurium，ST）是家禽生产中最重要的食源性病原菌之一，对动物健康和食品安全构成重大威胁。雏鸡口服感染ST后，病原菌易定植于肠道，引起肠道炎症、上皮损伤、生长迟缓和持续排菌，从而增加禽产品污染和食物链传播风险。新孵出雏鸡因肠道屏障未成熟、免疫系统发育不全和肠道菌群不稳定而尤其易感。抗生素虽被广泛用于控制ST感染，但长期大量使用加速了耐药性产生，并引发药物残留和食品安全担忧。因此，开发安全有效的非抗生素策略以控制ST感染并维持肠道健康，是现代家禽生产的优先方向。

植物来源多糖因具有抗氧化、抗炎和免疫调节活性而作为天然饲料添加剂受到广泛关注。紫花地丁多糖（*Viola philippica* polysaccharides，VPP）具有多种生物活性，在缓解氧化应激和炎症反应方面显示出潜力。硒是参与抗氧化防御和免疫调节的必需微量元素，硒修饰已被证明可增强天然多糖的生物活性，尤其是抗氧化和抗炎能力。据此推测，硒化紫花地丁多糖（selenium-modified *V. philippica* polysaccharides，SVPP）可能对病原体引起的肠道损伤提供更好的保护。酵母微囊（yeast microcapsules，YM）来源于酿酒酵母细胞壁，具有生物相容性好、成本低、来源丰富和独特中空多孔结构等优点，能保护包封的生物活性物质免于环境降解，并提供足够的内部空间。基于此，研究人员假设将SVPP包封于酵母微囊中可增强其生物学功效，并在雏鸡体内对ST诱导的肠道损伤提供保护。该研究制备并表征了SVPP@YM，在脂多糖（LPS）刺激的HD11巨噬细胞中评估了其细胞摄取、抗氧化和抗炎活性，并在雏鸡模型中研究了其抗ST感染的保护作用，重点关注肠道屏障完整性、炎症反应、氧化应激及肠道菌群。研究发现，SVPP@YM通过协同调节巨噬细胞活化、肠道屏障功能、氧化应激和肠道菌群，有效减轻了ST诱导的肠道损伤，为控制家禽沙门氏菌感染和改善肠道健康提供了潜在的无抗生素策略。

研究人员采用的主要关键技术方法包括：利用硝酸-亚硒酸钠法制备SVPP，通过碱法和酸处理从酵母细胞制备YM，并将两者复合构建SVPP@YM；采用动态光散射（DLS）、扫描电子显微镜（SEM）、透射电子显微镜（TEM）和傅里叶变换红外光谱（FT-IR）表征其理化性质；通过CCK-8法、FITC标记结合流式细胞术评估HD11细胞活力和细胞摄取；利用LPS诱导HD11细胞炎症和氧化应激模型，检测NO、ROS、MDA、GSH-Px、SOD及相关细胞因子mRNA表达；在体内实验中，选用1日龄健康雌性海兰褐蛋雏鸡，随机分为8组，经口灌胃ST菌株SL1344建立感染模型，随后给予不同处理，并通过临床评分、体重、免疫器官指数、空肠组织病理学、免疫组化、ELISA、qRT-PCR及16S rRNA测序等评估保护效果。16S rRNA原始数据已提交至NCBI SRA数据库（BioProject登录号PRJNA1520948）。

**SVPP@YM的表征**
DLS分析显示，SVPP平均粒径为677.54 ± 51.28 nm，Zeta电位为-45.69 ± 0.40 mV；包封后SVPP@YM粒径增至2320.14 ± 159.03 nm，Zeta电位变为-22.19 ± 0.45 mV。SVPP@YM的包封率和载药量分别为46.50 ± 2.80%和30.07 ± 1.71%。TEM和SEM观察显示，SVPP呈不规则聚集体和片层结构，而SVPP@YM呈更规则、致密的微囊样形态。FT-IR光谱表明VPP、SVPP和SVPP@YM均保留典型多糖吸收峰，约895 cm^-1处特征吸收提示酵母微囊结构中存在β-糖苷键，约820 cm^-1附近新峰可能与含硒基团有关。该结果表明SVPP@YM构建成功并保留了SVPP的多糖特征结构。

**SVPP@YM对HD11细胞的体外作用**
在3.125、6.25和12.5 μg/mL浓度下，SVPP和SVPP@YM对HD11细胞均无显著细胞毒性。细胞摄取实验显示，FITC-SVPP的摄取率为12.90 ± 0.40%，而FITC-SVPP@YM的摄取率增至43.63 ± 0.53%。LPS刺激显著增加HD11细胞ROS产生，SVPP@YM处理能有效降低细胞内ROS水平，且抑制作用强于SVPP。此外，SVPP@YM-H（12.5 μg/mL）显著抑制LPS诱导的NO产生，且效果优于SVPP-H。SVPP@YM还显著下调LPS诱导的TNF-α、IL-1β和IL-10 mRNA表达，降低MDA含量，恢复GSH-Px活性和SOD mRNA表达，且整体效果优于SVPP，接近地塞米松（DEX）阳性对照组。

**SVPP@YM缓解雏鸡ST诱导的系统性损伤**
在雏鸡模型中，ST攻毒导致临床症状评分升高、体重增长显著降低。SVPP和SVPP@YM处理均能降低临床症状评分并改善体重增长，其中SVPP@YM效果优于SVPP。ST组雏鸡胸腺指数和法氏囊指数显著下降，脾脏指数显著升高；SVPP及SVPP@YM-H处理显著提高胸腺和法氏囊指数并降低脾脏指数，且SVPP@YM-H在恢复免疫器官指数方面优于SVPP。

**空肠形态**
对照组空肠绒毛完整且排列规则，ST攻毒引起明显黏膜损伤，表现为绒毛缩短、紊乱和部分融合。YM处理改善有限，SVPP部分恢复绒毛形态；SVPP@YM进一步恢复了绒毛结构和排列，使其形态接近对照组和氟苯尼考组。

**SVPP@YM对ST感染雏鸡肠道屏障功能和黏膜免疫的影响**
ST组空肠黏膜ZO-1阳性染色显著减少，ZO-1、Claudin-1和Occludin的mRNA表达显著下调；SVPP和SVPP@YM组均显著增强ZO-1阳性染色并上调上述紧密连接蛋白表达。ST感染显著降低空肠sIgA含量，SVPP和SVPP@YM均显著提高sIgA水平；与SVPP相比，SVPP@YM在恢复紧密连接蛋白表达和增加sIgA含量方面效果更优。

**SVPP@YM保护肠道屏障功能并缓解炎症和氧化应激反应**
ST组空肠中TNF-α、IL-1β和IL-10 mRNA表达显著升高，MDA含量增加，GSH-Px活性和SOD mRNA表达下降。SVPP和SVPP@YM处理均不同程度逆转这些变化，且SVPP@YM在降低炎症细胞因子表达、减少MDA及恢复GSH-Px和SOD表达方面显著优于SVPP。

**SVPP@YM恢复ST感染雏鸡盲肠微生物群稳态**
ST感染降低盲肠微生物Shannon和Simpson多样性指数；SVPP部分恢复，SVPP@YM则更显著提高两个指数。PCoA分析显示各组微生物群落结构明显分离，PERMANOVA分析证实组间差异显著。在门水平，ST感染降低Firmicutes相对丰度并增加Proteobacteria相对丰度；SVPP和SVPP@YM部分恢复门水平组成，其中SVPP@YM组更接近对照组。在属水平，ST感染增加*Escherichia-Shigella*和*Enterococcus*相对丰度；SVPP@YM处理提高*Lactobacillus*和*Blautia*相对丰度，同时降低*Escherichia-Shigella*和*Enterococcus*丰度。Spearman相关性分析显示，*Escherichia-Shigella*丰度与ZO-1、Claudin-1、sIgA、GSH-Px和SOD呈显著负相关，与Occludin呈显著负相关；与MDA、IL-1β和TNF-α呈显著正相关。*Blautia*丰度与IL-10呈负相关，而*Lactobacillus*丰度与所测参数无显著相关性。

讨论部分指出，ST感染引起肠道炎症和生长迟缓，抗生素滥用加剧耐药性问题，亟需安全替代策略。巨噬细胞是识别ST并启动先天免疫的重要细胞。本研究中，HD11细胞对SVPP@YM的摄取效率高于游离SVPP，可能归因于酵母微囊表面的β-葡聚糖被巨噬细胞表面受体识别。SVPP@YM能有效抑制LPS诱导的ROS和NO过量产生，减轻氧化损伤和炎症信号放大。在雏鸡体内，SVPP@YM缓解了ST感染导致的胸腺和法氏囊指数下降及脾脏肿大，表明其可减轻全身性损伤并促进免疫器官功能恢复。肠道上皮是抵御肠道病原体的第一道物理和免疫屏障，紧密连接蛋白和分泌型IgA对维持屏障完整性和黏膜防御至关重要；SVPP@YM通过恢复绒毛结构、增加紧密连接蛋白表达和sIgA含量，同时增强物理屏障和黏膜免疫防御。肠道菌群稳态在调节屏障功能和定植抗性中发挥关键作用；SVPP@YM部分恢复了ST引起的微生物群落紊乱，降低*Escherichia-Shigella*丰度，这可能与改善肠道屏障和抗氧化状态、减轻炎症和脂质过氧化有关。

研究结论可翻译为：总之，SVPP@YM被成功构建为基于酵母微囊的SVPP递送系统。SVPP@YM表现出良好的细胞相容性、增强的细胞摄取，并缓解了HD11细胞中LPS诱导的炎症和氧化应激反应。在ST感染雏鸡中，SVPP@YM有效改善了全身健康，维持了肠道完整性，增强了黏膜防御，并部分恢复了盲肠微生物群稳态。总体而言，这些发现表明SVPP@YM可作为缓解雏鸡ST感染和改善肠道健康的一种有前景的无抗生素策略。