"羟基酪醇经TLR4/NF-κB通路抑制NLRP3炎症小体活化与细胞焦亡以缓解鸡毒支原体感染所致炎症损伤"

《Poultry Science》：Hydroxytyrosol restrains NLRP3 Inflammasome Activation and Pyroptosis through the TLR4/NF-κB Pathway to Prevent Mycoplasma gallisepticum-Inflammation

　　

鸡毒支原体（Mycoplasma gallisepticum，MG）作为一种重要病原体，可引起家禽慢性呼吸道疾病（chronic respiratory disease，CRD），以咳嗽、喘息和呼吸困难为特征。这一广泛流行的疾病严重阻碍了家禽养殖业的健康发展。羟基酪醇（Hydroxytyrosol，HT）是一种植物来源的单体化合物，具有抗菌、抗氧化和心血管保护等多种生物活性。本研究旨在探讨HT对MG诱导的HD11细胞炎症损伤的保护作用。研究结果表明，MG感染激活了TLR4/NF-κB信号通路及NLRP3炎症小体，导致雏鸡肺组织中巨噬细胞积聚和炎症损伤。HT减轻了MG诱导的HD11细胞炎症损伤，抑制了M1表型转化，并减少了促炎因子的分泌。分子对接和分子动力学模拟证实HT能够与NLRP3发生稳定、自发的结合。进一步研究表明，HT通过调控TLR4/NF-κB通路减轻氧化应激诱导的细胞损伤，降低病理性凋亡和孔道形成，同时抑制NLRP3活化，进而下调关键焦亡因子的表达。综上所述，HT通过特异性抑制TLR4/NF-κB信号轴降低NLRP3炎症小体活化，从而减轻MG感染诱导的HD11细胞炎症损伤、氧化应激和细胞焦亡。

本研究围绕鸡毒支原体（Mycoplasma gallisepticum，MG）感染所致家禽慢性呼吸道疾病的炎症损伤机制及天然药物干预展开。MG是一种缺乏细胞壁、仅由细胞膜包被的微小原核生物，在全球广泛流行，中国样本感染率高达75.04%，秋冬季节为高发期。MG感染引起鸡只气管炎、气囊炎和肺炎，表现为咳嗽、喘息和呼吸困难，导致生长迟缓和体重下降，严重制约集约化家禽养殖业发展。MG通过黏附蛋白定殖于呼吸道纤毛上皮，损害纤毛功能并刺激巨噬细胞分泌促炎因子，诱发持续性肺部炎症。巨噬细胞作为家禽先天免疫的主要效应细胞，通过模式识别受体（pattern recognition receptors，PRRs）识别病原入侵，病原相关脂蛋白激活TLR2/TLR4信号级联，触发NF-κB核转位及促炎基因转录，可导致巨噬细胞过度向M1表型极化，过量产生促炎细胞因子和活性氧（reactive oxygen species，ROS），加剧炎症并诱导氧化应激损伤。TLR4/NF-κB通路的过度刺激还可导致NLRP3大量积聚，与ASC和pro-Caspase-1组装形成炎症小体，激活Caspase-1并促进GSDMD N端释放，在细胞膜上寡聚打孔，释放IL-1β和IL-18等促炎因子，诱导巨噬细胞焦亡，不断放大炎症反应。然而，MG菌株抗生素耐药性日益增强，药物残留风险突出，亟需开发新型天然防治策略。羟基酪醇（Hydroxytyrosol，HT）是橄榄制品中橄榄苦苷水解形成的多酚类化合物，具有抗氧化、抗炎和神经保护活性，已有研究证实其可降低脂多糖刺激巨噬细胞的炎症因子水平，但HT能否缓解MG感染炎症损伤尚不清楚。研究人员以TLR4/NF-κB通路为切入点，探讨HT是否调控NLRP3炎症小体介导的HD11细胞焦亡，以期为开发治疗禽支原体肺炎的天然靶向药物提供理论依据。

研究人员通过体内外相结合的策略开展研究：体内实验以15只7日龄SPF雄性雏鸡为研究对象，随机分为对照组、MG组和TAK-242+MG组，通过气囊接种MG F株（1×10⁹ CCU/mL，0.2 mL/只）建立感染模型；体外实验以HD11鸡巨噬细胞为模型，分别采用TLR4抑制剂TAK-242（10 μM）、NLRP3抑制剂MCC950（10 μM）及HT（100 μM）进行预处理。主要技术方法包括H&E染色、透射电镜、免疫组织化学、qPCR、CCK-8细胞活力检测、分子对接（Autodock Vina）与100 ns分子动力学模拟（GROMACS 2025.2）、免疫荧光、NO检测、ELISA、DCFH-DA探针、氧化应激标志物检测、JC-1线粒体膜电位检测、Western blot及Hoechst 33342/PI双染等。

**MG感染经TLR4/NF-κB通路激活NLRP3导致雏鸡肺脏损伤**。H&E染色显示MG组肺组织广泛炎性细胞浸润、肺泡壁增厚及形态结构异常；透射电镜观察到细胞肿胀、线粒体肿胀伴嵴断裂及粗面内质网池扩张。免疫组化显示MG组巨噬细胞标志物KUL01和NLRP3蛋白表达增加（P<0.01）；qPCR显示TLR4、NF-κB、NLRP3和IL-1β mRNA相对转录水平显著上调（P<0.01），TAK-242干预后上述病理改变和分子表达均得到改善，表明MG感染激活TLR4/NF-κB通路继而活化NLRP3炎症小体，导致雏鸡肺脏病理性损伤。

**MG上调HD11细胞TLR4/NF-κB/NLRP3通路**。以MOI 400建立HD11细胞感染模型，H&E染色显示MG组细胞显著肿胀、核染色质分布不均、胞质淡染；qPCR显示TLR4、NF-κB、NLRP3、IL-1β和IL-6 mRNA水平显著升高（P<0.01），证实MG感染HD11细胞激活TLR4/NF-κB/NLRP3