脂蛋白(a)免疫比浊法检测中分析异常值的识别与解决

《Practical Laboratory Medicine》：Identifying and Resolving Analytical Outliers in Lipoprotein(a) Immunoassay Testing

　　

脂蛋白(a)[Lp(a)]是一种含有载脂蛋白(a)[Apo(a)]和载脂蛋白B-100(ApoB-100)的低密度脂蛋白(LDL)样脂质颗粒，与动脉粥样硬化性心血管疾病(ASCVD)、主动脉瓣狭窄、心力衰竭及缺血性卒中独立相关。血浆Lp(a)浓度主要由遗传决定(约90%)，部分取决于个体LPA基因中kringle-IV亚型2(KIV-2)重复序列数目，KIV-2重复数目较少与较小Apo(a)异构体尺寸及较高的ASCVD死亡风险相关。鉴于其遗传基础，常主张终生一次Lp(a)检测(或至少终生一次测量)可能足以识别ASCVD高风险患者。若目前正在研发中的Lp(a)降低疗法在 ongoing 临床试验中取得成功并获得监管批准，预计Lp(a)筛查将扩展至更广泛人群。然而，终生一次检测依赖于Lp(a)免疫测定的准确性、精密度和可靠性。鉴于过去几年Lp(a)临床关注度日益增加，近期研究已将注意力转向Lp(a)测量的分析性和生物性变异。重复测量虽显示出统计学显著相关性，但大型数据集中基线与随访测量之间的散点分布确实表现出比遗传决定分析物浓度所预期更宽的变异和更频繁的“异常值”。此外，重复测量甚至可能导致患者风险重新分类，提示生物性和/或分析性变异可能具有临床影响。研究人员假设分析性或分析前变异可能是Lp(a)免疫比浊结果不准确的一个组成部分。本报告描述了针对多种FDA批准的Lp(a)免疫测定中观察到的散发性不准确结果所开展的调查，以及如何通过最小化此类异常值的发生来提高Lp(a)检测的分析有效性。

论文解读：脂蛋白(a)免疫比浊法检测中分析异常值的识别与解决

一、研究背景与问题

脂蛋白(a)[Lp(a)]是一种含有载脂蛋白(a)[Apo(a)]和载脂蛋白B-100(ApoB-100)的低密度脂蛋白(LDL)样脂质颗粒，与动脉粥样硬化性心血管疾病(ASCVD)、主动脉瓣狭窄、心力衰竭及缺血性卒中独立相关。血浆Lp(a)浓度主要由遗传决定(约90%)，部分取决于个体LPA基因中kringle-IV亚型2(KIV-2)重复序列数目。鉴于其遗传基础，临床上常主张终生一次Lp(a)检测即可识别ASCVD高风险患者。然而，随着Lp(a)降低疗法在临床试验中取得进展并有望获得监管批准，Lp(a)筛查预计将扩展至更广泛人群，这对Lp(a)免疫测定的准确性、精密度和可靠性提出了更高要求。近期多项大规模研究，包括社区动脉粥样硬化风险研究和英国生物库研究，均观察到Lp(a)重复测量虽然存在统计学显著相关，但基线与随访结果之间的散点分布较预期更宽，且异常值出现频率更高，甚至可能导致患者风险重新分类。这一现象提示生物性和/或分析性变异可能具有临床影响。基于此，研究人员假设分析性或分析前变异可能是Lp(a)免疫比浊结果不准确的一个组成部分，并据此开展了系统调查，旨在识别异常值的可能原因并探索最小化其发生的方法。

二、研究内容与主要结论

研究人员在临床实验室开展了一项多阶段、多平台的异常值调查。首先，在临床实验室所有Lp(a)检测均采用重复检测的排障期间，从ARUP Laboratories企业数据仓库中提取了26,637份标本的检测数据，其中20,832份(78.2%)标本的原始和重复结果均在分析测量范围(AMR)内并纳入异常值分析。结果发现其中0.2%(n=49)被归类为异常值。在此基础上，研究人员进一步利用先前检测过、经去标识化处理并在-20°C冷冻保存的患者标本，开展了跨平台实验性重复检测研究。这些实验涵盖了Roche(罗氏)Tina-quant Lp(a) Gen.2测定法、Randox(兰多克斯)Lp(a)测定法和Diazyme(莱兹明)Lp(a)测定法，在Roche c503和Beckman Coulter AU5800两种仪器平台上进行。实验结果表明，在Randox(c503平台，测量点调整后)、Randox(AU5800平台)和Diazyme(c503平台)实验组中均观察到了AMR内异常值。经厂商指导对测定参数进行微小调整和优化，确保反应混合物充分混匀并加强反应间仪器清洗步骤后，Diazyme测定法在AU5800平台的两组重复检测实验中均未观察到异常值，在c503平台上仅观察到1例。研究人员由此得出结论：乳胶增强免疫比浊法Lp(a)检测易受分析异常值影响，通过优化试剂/样本混合和清洗步骤可有效减少异常值发生。鉴于Lp(a)测定通常为一次性ASCVD风险分层检测，测定不精密度可能对临床医生理解患者Lp(a)浓度产生负面影响，而在靶向Lp(a)调节疗法正在研发的背景下，考虑治疗干预时确保准确测量至关重要。

三、主要关键技术方法

研究人员开展临床标本重复检测时，使用Roche Tina-quant Lp(a) Gen.2测定法(罗氏诊断)在cobas c503仪器上配置mg/dL单位，对去标识化临床标本进行一式两份检测，数据检索依据犹他大学机构审查委员会(IRB)批准的方案(#00082990)。实验性重复检测研究则依据另一IRB批准方案(#0007275)，采用先前检测过、去标识化的冷冻(-20°C)患者标本，在相同型号仪器上重复检测。方法涉及运用Bland-Altman分析、线性回归和残差计算。实验设计包括测量点调整实验(使用cobas Development Channel File Creator将测量点从19调整为20)以及厂商指导的仪器配置参数优化，以确保充分的试剂/标本混合及相应的仪器清洗步骤。异常值判定依据皇家病理学家学院质量保证计划(RCPAQAP)规定的总允许误差(TEa)限值：平均值<30 mg/dL(<75 nmol/L)时绝对差≥±6 mg/dL(±15 nmol/L)，平均值≥30 mg/dL(≥75 nmol/L)时百分差≥20%。

四、研究结果

(一)临床标本重复检测结果

在排障期间，使用Roche Tina-quant Lp(a) Gen.2测定法在Roche c503仪器上对所有Lp(a)检测进行一式两份。从26,637份标本中，20,832份(78.2%)的原始和重复结果均在AMR内并纳入分析，其中0.2%(n=49)被分类为异常值。由此证明在常规临床标本中确实存在分析异常值。

(二)跨测定法和仪器平台的实验性重复检测结果

仪器服务和维护以及分析前实验室流程评估(如离心、混匀、随机访问与批处理检测、稳定性)均未能消除多年调查中观察到的散发性差异。在Randox(c503平台，测量点调整后)、Randox(AU5800平台)和Diazyme(c503平台)实验中均观察到AMR内异常值，异常率分别为1.6%(n=3)、2.4%(n=3)和3.2%(n=3)。Randox c503平台测量点调整前未观察到AMR内异常值，但有两个超出AMR的标本在后续精密度研究中显示差异结果，提示还存在其他异常因素。

(三)Diazyme测定法优化后的实验性重复检测结果

经厂商指导对Diazyme测定法配置参数进行优化，确保试剂/标本充分混匀和仪器清洗步骤充分后，在c503平台上(n=128)仅观察到1例异常值(0.8%)，该标本首次结果为18.2 mg/dL(低风险)，重复结果为33.6 mg/dL(中风险)，可导致临床风险分层改变。AU5800-1(n=130)和AU5800-2(n=130)平台上均未观察到异常值。这证明通过优化混匀和清洗步骤可有效减少异常值发生。

五、讨论与结论总结

讨论部分指出，优化分析前、仪器前流程并不能解决异常值现象。乳胶增强免疫比浊法Lp(a)测定的异常值可通过厂商指导的测定参数优化得到最小化，以确保反应混合物充分混匀并在反应间进行充分的仪器清洗。观察到的异常值中，24例可直接归因于研究人员所在实验室的调查，3例可能但不完全确定归因于该实验室调查，3例与调查无关。在可公开获取的FDA制造商和用户设施设备经验(MAUDE)报告中，初步测定厂商将异常值归因于“实验室特定环境因素”及实验室使用试剂和控制品的操作规范。研究人员通过替代测定法和替代仪器的内部实验减少了异常值发生。讨论还强调，Lp(a)测定正在向nmol/L校准和报告方向发展，理想情况下可溯源至WHO/IFCC SRM-2B参考物质。现有的Lp(a)降低疗法包括PCSK-9抑制剂(可使Lp(a)降低约20-30%)，以及靶向Apo(a)的小干扰RNA(siRNA，如olpasiran、zerlasiran、lepodisiran)和反义寡核苷酸(ASO，如pelacarsen)等新型疗法。研究人员未观察到异常值现象与校准单位(mg/dL或nmol/L)相关的证据。结论部分指出，虽然未确定根因，且可能代表一个或多个分析前或分析因素，但本报告证明乳胶增强免疫比浊法Lp(a)方法可能出现异常值，通过优化试剂/标本混合和清洗步骤可最大限度减少异常值。鉴于Lp(a)测定通常作为ASCVD风险分层的一次性检测，测定不精密度可能对临床医生理解患者Lp(a)浓度产生负面影响；在靶向Lp(a)调节疗法正在研发的背景下，考虑治疗干预时确保准确测量至关重要。