转录组学揭示PbCAND2-Ca2?信号在褪黑素诱导库尔勒香梨抗病性中的作用

《Postharvest Biology and Technology》：Transcriptomics reveals the role of PbCAND2-Ca2? signaling in melatonin-induced disease resistance of Korla fragrant pears

　　

•褪黑素处理可增强库尔勒香梨果实的抗病性。
•褪黑素可触发梨果实中褪黑素(MT)的生物合成及PbCAND2基因的表达。
•褪黑素通过激活Ca2?内流来调控梨果实中CAM和CML蛋白的水平。
•差异表达基因富集于次生代谢生物合成、碳水化合物代谢及氨基酸代谢途径。
•PbCAND2-Ca2?信号通路参与梨果实抗病性的调控。

1. 引言

库尔勒香梨（Pyrus sinkiangensis Yu）是新疆具有代表性的水果品种之一，因其果肉酥脆细嫩、汁多味美、风味独特且营养丰富而深受消费者喜爱（Li et al., 2007; Mamat et al., 2021）。然而，采后梨果实极易受到病原真菌的侵染而引发病害，尤其是由链格孢菌（Alternaria alternata）引起的炭疽病（黑斑病），其典型症状包括：感染部位果皮收缩、果肉颜色由白色变为褐色，以及病斑渗出黑色黏稠液体（Zhang et al., 2026; Sun et al., 2025）。这严重降低了果实的商品价值并造成了经济损失。近年来，已采用一系列方法来控制库尔勒香梨果实的采后病害，包括1-甲基环丙烯（1-MCP）（Zhang et al., 2026）、紫外-C（UV-C）辐照（Sun et al., 2022）以及一氧化氮（NO）（Zheng et al., 2023）等。尽管这些研究表明，1-MCP可通过调控基因、代谢物及脂肪酸组成来增强香梨果实的抗病性；UV-C辐照可通过提高抗氧化酶活性和促进酚类物质的生物合成来诱导对链格孢菌的抗性；NO可通过激活抗性相关酶和促进抗氧化物质积累来缓解链格孢菌引起的病害，但上述策略往往受限于高昂的成本、复杂的设备要求及潜在的安全风险，从而限制了其实际应用。因此，迫切需要开发新型、有效且环境友好的防控方法，以降低梨果实的发病率，促进库尔勒梨产业的可持续发展。

褪黑素（MT）是一种天然存在的吲哚胺类化合物，凭借其强烈的生物活性和多功能特性，在多种植物生理过程中发挥着广泛的调控功能（Aghdam and Arnao, 2024; Shahani et al., 2023）。在植物中，MT的生物合成主要发生在细胞器和叶绿体区室中，其信号感知依赖于G蛋白偶联受体候选蛋白2/植物褪黑素受体（CAND2/PMTR1）及其同源蛋白（Chen and Arnao, 2022）。MT的生物合成主要受外源褪黑素的调控，外源MT可激活色胺-5-羟化酶（T5H）、色氨酸脱羧酶（TDC）、N-乙酰血清素甲基转移酶（ASMT）和5-羟色胺N-乙酰转移酶（SNAT）的转录，从而引发植物防御反应（Liu et al., 2019; Sharafi et al., 2019）。近年来，外源MT处理已被广泛应用于控制采后园艺作物的病害发展。例如，外源MT可保持芒果果实品质并减轻炭疽病的发展（Khobragade et al., 2025），增强灵宝苹果果实对青霉属真菌的耐受性（Xu et al., 2025），并有效抑制猕猴桃果实中灰葡萄孢菌的生长和致病性（Liu et al., 2026）。这些有益效果主要归因于其在抗氧化防御、减少脂质氧化以及调控苯丙烷类和细胞壁代谢方面的作用。在梨果实中，MT处理促进了茉莉酸、表儿茶素和源MT的生物合成，激活了苯丙烷代谢、抗氧化系统和抗病蛋白活性，同时抑制了细胞壁降解，从而诱导了对病原菌侵染的抗性（Xu et al., 2024; Xiang et al., 2022a; Xiang et al., 2022b; Cheng et al., 2026）。然而，MT对梨果实抗病性的积极作用是否依赖于MT信号转导过程及其与其他信号的相互作用，特别是与钙（Ca2?）信号的互作，目前仍知之甚少。

Ca2?信号是植物对外部刺激应答中的关键第二信使，也是植物免疫和胁迫信号的关键调节因子。Ca2?信号可被多种Ca2?结合蛋白感知，包括钙调蛋白/钙调蛋白样蛋白（CaM/CMLs）、钙调磷酸酶B样蛋白（CBLs）、钙依赖型蛋白激酶（CDPKs/CPKs）和CBL互作蛋白激酶（CIPKs），它们均作为植物中的Ca2?传感器（Ghosh et al., 2022）。其中，CDPKs/CPKs可感知Ca2?信号的变化，调节下游抗病基因的转录水平，并诱导防御相关蛋白的合成，最终实现对病原胁迫的有效防御（Wang et al., 2026）。越来越多的证据表明，Ca2?信号参与了冬枣（Xu et al., 2024）、梨（Liu et al., 2019）和樱桃番茄（Zhou et al., 2025）分别对链格孢菌、梨黑星菌（Venturia nashicola）和加勒比皮氏酵母菌（Pichia caribbica）侵染的抗病性诱导。此外，一些研究还揭示，Ca2?信号在抗病性调控中并非独立发挥作用，而是与MT信号相互作用，协同调节植物防御反应。例如，Li等人（2026）发现，褪黑素可上调ClCNGC20的表达而下调ClCaM7的表达，从而激活Ca2?内流并触发下游防御反应，通过钙信号通路增强植物对昆虫的抗性。在紫花苜蓿中，褪黑素与Ca2?协同增强了耐盐性，通过放大Ca2?信号来更有效地激活下游抗氧化防御、离子稳态和光合保护途径（Guo et al., 2025）。尽管这些证据表明Ca2?和MT信号之间存在串扰以调节植物防御反应，但MT信号是否专门通过激活Ca2?信号来赋予库尔勒香梨的抗病性仍不清楚，而褪黑素受体CAND2/PMTR1在此过程中的作用更是鲜有报道。

转录组学技术用于分析基因组产生的所有RNA转录本，已被广泛应用，能够对生物胁迫下园艺作物的调控网络进行全面探索（Rurek and Smolibowski, 2024）。例如，转录组分析揭示，Ca2?和激素信号级联均参与了哈茨木霉菌NDT-1在番茄中诱导的灰霉菌防御反应，该过程由多种调控组分共同协调，包括有丝分裂激活蛋白激酶3（MPK3）、病原诱导型转录因子（Pti5/6）和WRKY转录因子22（WRKY22）作为防御相关基因的正向调控因子，以及作为转录后事件关键调控因子的非编码RNA（ncRNAs）（Wang et al., 2026）。此外，对感病桃品种（XH8）和易感品种（XH6）在褐腐病侵染后的转录组分析揭示了相关基因网络：抗病品种快速激活了一系列关键抗性基因，包括核苷酸结合富亮氨酸重复受体（PpNLRs）和环核苷酸门控通道（PpCNGCs），触发Ca2?信号、活性氧（ROS）爆发、过敏性坏死反应（HR）、木质素积累，以及增强病程相关蛋白（几丁质酶和β-1,3-葡聚糖酶）的活性，从而提高抗病性（Li et al., 2024）。在梨果实中，对链格孢菌侵染的转录组分析揭示，PbWRKY33是苯丙烷代谢途径（PbPAL、Pb4CL、PbC4H、PbCAD、PbPOD、PbLAC、PbHCT、PbCCoAOMT、PbCCR、PbF5H和PbCOMT等）和脂肪酸代谢途径（PbPLA1、PbPLC、PbPLD、PbLOX、PbHPL、PbADH、PbAAT、PbECH和PbACOX3等）的关键调控因子（Wang et al., 2026a）。总体而言，这些发现验证了转录组学是阐明转录调控网络并进行未来机制探索的关键方法。

因此，本研究采用转录组学分析来探究Ca2?信号在褪黑素增强库尔勒香梨黑斑病抗性中的调控作用，旨在为褪黑素在梨采后病害管理中的应用提供理论基础。

2. 材料与方法

2.1. 果实材料及处理

库尔勒梨于新疆在商业成熟期采收（可溶性固形物含量为12.34%~13.20%；硬度为12.27~13.44 N）。选取果形和大小均匀、无可见损伤或病害的果实，随机分为两组，每组12个果实（含3次重复）。从感病的库尔勒香梨果实中分离纯化链格孢菌，进行培养，并通过血细胞计数板计数将孢子密度标准化为每升10?个孢子。先用75%乙醇对梨果实表面进行灭菌处理，然后用无菌针在每个果实赤道两侧对面各刺两个伤口（每个伤口大小为3.0 mm × 3.0 mm）。随后，为确定控制病害的最佳MT浓度，在体外进行抗真菌试验和梨果实体内的预浓度筛选。在所测试的浓度（0.10、0.20和0.40 mmol L?1）中，0.20 mmol L?1对库尔勒香梨果实中的链格孢菌表现出最强的抑制活性，因此被选定为最佳浓度。随后，向每个伤口注射20 μL的0.20 mmol L?1 MT溶液，对照组则注射等体积的无菌水。经24 h诱导期后，向每个伤口接种20 μL链格孢菌孢子悬浮液（1 × 10? spores L?1）。此后，将果实保存在25 ℃和95%相对湿度条件下12天。每隔2天从两组中采集果实样本，置于液氮中速冻后转入-80 ℃保存，以待进一步分析。

2.2. 病斑直径和病情指数的测定

采用交叉测量法，使用游标卡尺测定病斑直径。病情指数参照Sun等人（2023）的方法略作调整进行计算。具体而言，根据受感染果实表面面积的比例，将病害严重程度分为6个等级（0~5级）：0级（无病斑）、1级（< 5%）、2级（5%~15%）、3级（15%~30%）、4级（30%~50%）和5级（≥ 50%）。病情指数的计算公式为：∑（等级 × 该等级果实数）/（最高等级 × 果实总数）。

2.3. 总酚和木质素含量及几丁质酶（CHI）、β-1,3-葡聚糖酶（β-1,3-Glu）、苯丙氨酸解氨酶（PAL）、4-香豆酰-CoA连接酶（4CL）、肉桂酸4-羟化酶（C4H）和肉桂醇脱氢酶（CAD）活性的测定

采用酶联免疫吸附测定（ELISA）试剂盒（上海一赫生物科技有限公司，中国）测定总酚和木质素含量，按照制造商推荐的程序操作。结果以每千克鲜重（FW）的毫克数表示。CHI、β-1,3-Glu、PAL、4CL、C4H和CAD的酶活性采用ELISA试剂盒（上海一赫生物科技有限公司，中国）测定。酶活性以每千克鲜重（FW）的单位数（U kg?1）表示。

2.4. 内源MT生物合成相关指标的测定

MT含量和TDC、T5H、SNAT、ASMT及咖啡酸-O-甲基转移酶（COMT）的酶活性测定参照ELISA试剂盒（上海一赫生物科技有限公司，中国）描述的方法进行。MT含量的结果以每千克鲜重（FW）的纳克数表示，而TDC、T5H、SNAT、ASMT和COMT的酶活性则以每千克鲜重（FW）的单位数（U kg?1）表示。

2.5. 系统发育分析、序列比对和亚细胞定位

根据转录组学和实时定量PCR（qRT-PCR）分析的结果，选择MT受体CAND2进行进一步的生物信息学分析。对于系统发育分析，检索了所有拟南芥（Arabidopsis thaliana，模式植物）中的CAND同源序列。将目标序列进行系统发育分析，以确定其在拟南芥谱系中最亲近的亲缘关系，从而基于进化上的接近程度进行功能推断。使用MEGA软件初步构建系统发育树，并利用基于网络的ITOL平台（https://itol.embl.de/）对结果拓扑结构进行可视化和优化。对于序列比对，首先使用BLAST工具将目标序列与NCBI数据库进行比对以鉴定密切相关的同源蛋白。检索这些同源蛋白的氨基酸序列，并使用DNAMAN软件进行多序列比对。为观察PbCAND2的亚细胞定位，从梨基因组中获取其完整CDS，并克隆至p1305-GFP载体中。将融合构建体及空载体对照分别转化至农杆菌中，随后在烟草叶片中进行瞬时表达。60 h后，用2 mM 4′,6-二脒基-2-苯基吲哚二盐酸盐（DAPI）对烟草叶片进行染色，并使用共聚焦激光扫描显微镜（A1RHD25，Nikon）在激发波长395 nm下进行观察。用于亚细胞定位的p1305-PbCAND2引物列于补充表S2中。

2.6. Ca2?分布及CAM、CML含量的测定

游离Ca2?的分布可视化参照Hou等人（2022）的方案略作调整。使用Fluo-4-AM制备染色液，然后使用Nikon A1RHD25共聚焦显微镜在488 nm激发波长下捕获Ca2?的荧光信号。CAM和CML的含量采用ELISA试剂盒（上海一赫生物科技有限公司，中国）进行定量测定，结果以每千克鲜重（FW）的皮克数（pg kg?1）表示。

2.7. RNA测序（RNA-Seq）分析

在0、2、6和12 d从两组中采集的梨果肉样本交由广州凯迪欧生物科技有限公司进行RNA-Seq分析。

# 材料与方法

## 2.8 加权基因共表达网络分析（WGCNA）

通过TBtools-II对8000个差异表达基因（DEGs）进行加权基因共表达网络分析。为实现无标度网络，对拓扑参数进行了优化，获得软阈值幂（β）为20（R2 > 0.90）和动态切割高度为0.20。模块检测的最小基因数为10个，最大基因块为6000个。该过程共产生12个合并模块，并计算了它们的特征基因值。随后，将这些特征基因与梨的生理性状（包括病斑直径、病害指数、褪黑素含量及PbCAND2表达）进行相关性分析。此外，鉴定了调控网络中的关键调控因子：（1）首先，基于KEGG富集分析，从模块中筛选了Ca2?信号通路相关基因和关键代谢的结构基因（SGs）；（2）其次，通过关键模块中Ca2?信号通路基因与转录因子（TFs）之间的Pearson相关分析（PCC）鉴定候选转录因子，随后将这些转录因子与上述代谢通路中的结构基因进行Pearson相关分析，以精确定位候选结构基因。最后，使用Cytoscape软件（版本3.8.0）进行调控网络的可视化展示。

## 2.9 转录因子结合位点（TFBS）与顺式作用元件分析

根据WGCNA和Ca2?信号通路相关基因的PCC分析，在关键模块中鉴定了13个关键转录因子。FootprintDB2021（http://floresta.eead.csic.es/footprintdb/index.php）和JASPAR2020（http://jaspar.genereg.net/）作为转录因子结合位点注释的数据来源。为预测下游靶标，我们利用MEME套件中的FIMO（Find Individual Motif Occurrences，https://meme-suite.org/meme/index.html）工具扫描各转录因子起始密码子上游2.0 kb启动子区域的基序。

## 2.10 qRT-PCR分析

使用植物总RNA提取试剂盒Plus（Foregene Biotechnology，成都）提取梨的总RNA。采用RT Easy? II（Foregene Biotechnology Co., Ltd.，成都）及qRT-PCR第一链cDNA合成预混液进行cDNA合成，随后使用ChamQ Universal SYBR qPCR Master Mix（Q711，Vazyme，南京）进行qRT-PCR检测。以PbActin-7（ncbi_103926846）作为内参基因，通过2^(-ΔΔCt)方法（Xu等，2015）定量相对转录水平。所有引物序列见补充表S1。

## 2.11 分子对接模拟

为进一步验证褪黑素（MT）与PbCAND2之间的相互作用，进行了分子对接分析。MT的三维结构从PubChem数据库获取（CID：896，https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/）。对于PbCAND2，采用了AtCAND2（UniProt：Q94AH1；AlphaFold模型编号AF-Q94AH1-F1；与PbCAND2蛋白一致性为61%；pLDDT > 90）的AlphaFold预测模型。PbCIPK4和PbCML29的同源模型通过SWISS-MODEL平台生成（https://swissmodel.expasy.org/）。MT与PbCAND2的分子对接通过AutoDock Tools软件采用Lamarckian遗传算法完成。此外，蛋白-蛋白对接使用HDOCK Server（http://hdock.phys.hust.edu.cn/）以默认参数（网格间距6.0 ?，旋转角度15°）进行，选取HDOCK得分最低的top 10模型进行分析。随后，使用PyMOL和Discovery Studio软件以3D和2D两种模式对分子间相互作用力进行分析和可视化。

## 2.12 统计分析

所有实验均设置3个生物学重复，结果以均值±标准差（SD，n = 3）表示。组间比较采用独立样本t检验（IBM SPSS Statistics版本22，SPSS Inc.，芝加哥，美国），显著性阈值设定为P < 0.05。

---

# 3 结果

## 3.1 不同浓度MT对Alternaria alternata的体外抗真菌实验

MT对Alternaria alternata菌丝生长的影响见图S1。体外实验表明，Alternaria alternata的病斑随培养时间延长而持续扩大（图S1A）。培养第4天和第10天时，0.10 mmol L?1和0.20 mmol L?1 MT处理组的菌落直径与对照组无显著差异，而0.40 mmol L?1处理组的病斑直径则显著大于对照组。第8天时，各处理组之间无显著差异（图S1B）。总体而言，这些结果表明所测试的MT浓度在体外均未对Alternaria alternata菌丝生长产生显著抑制作用。

## 3.2 MT对库尔勒香梨炭疽病的最适浓度筛选

病原菌接种后，香梨的病斑直径和病害指数随时间呈上升趋势，且均被所有MT浓度（0.10、0.20和0.40 mmol L?1）显著抑制（图S2A、B）。在这些浓度中，0.20 mmol L?1 MT处理的果实显示出最低病斑直径和病害指数，储存第12天时分别比对照组低17.37%和10.52%。因此，选择0.20 mmol L?1 MT作为后续分析的最适浓度。

## 3.3 MT诱导香梨对炭疽病的抗性

如图1A-C所示，随着储存时间的延长，对照组梨果的可见病害症状逐渐恶化，病斑直径和病害指数随之增加。相比之下，MT处理显著抑制了储存期间梨果病斑直径和病害指数的增加。储存第12天时，MT处理果实的病斑直径和病害指数分别为14.40 mm和24.40%，与对照组相比分别降低了35.14%和46.76%。

 

**图1. MT处理对梨果储存期间病害发生率的影响。** （A）梨果炭疽病症状。（B-C）储存期间梨果病斑直径和病害指数。（D-E）储存期间梨果总酚含量和木质素含量。（F-K）梨果中CHI活性、β-1,3-Glu活性、PAL活性、4CL活性、C4H活性和CAD活性。竖线表示均值的SD（n = 3）。不同字母表示对照组与MT处理组之间在P < 0.05水平上的显著差异。

梨果中的总酚含量和木质素含量也进行了测定（图1D-E）。对照组和MT处理组在储存期间总酚含量均呈波动上升趋势，但MT处理在整个储存期间的总酚含量始终高于对照果实。对照组木质素含量在储存期间缓慢增加，而MT处理在整个储存期间均提高了木质素含量。梨果中CHI和β-1,3-Glu活性在病原菌感染下先上升后下降，随后再次上升，而MT处理促进了储存梨果中这些酶活性的提高（图1F-G）。

此外，图1H-K展示了梨果中包括PAL、4CL、C4H和CAD在内的防御相关酶的活性。随着储存时间延长，PAL活性总体呈上升趋势（图1H）。与对照组相比，MT处理组的PAL活性在整个储存期间始终高于对照组，储存第12天时达到12.81 U kg?1，为对照组的1.16倍。值得注意的是，梨果中4CL活性先上升并在储存第2天达到峰值，随后逐渐下降；MT处理在储存期间能维持比对照组更高的4CL活性（图1I）。两组C4H酶活性在储存期间均呈现波动变化（图1J），但MT处理果实的C4H活性在整个储存期间始终高于对照组。储存第6天和第12天时，MT处理果实的C4H活性分别为43.41 U kg?1和40.90 U kg?1，比对照组分别高20.15%和24.35%。两组CAD活性在储存期间均呈总体上升趋势，MT处理在整个储存期间均能增强梨果的CAD活性（图1K）。储存第12天时，MT处理组和对照组的CAD活性分别达到峰值4.44 U kg?1和3.84 U kg?1，比对照组提高了15.63%。综上所述，这些结果表明MT处理激活了防御酶活性并提高了酚类物质含量，有助于抑制病原菌感染后香梨的病害发生率。

## 3.4 MT激活了储存库尔勒香梨果实中内源性MT生物合成和PbCAND2表达

MT对梨果接种后褪黑素生物合成的影响如图2所示。梨果中MT含量随储存时间延长而逐渐下降，而外源MT处理显著抑制了储存期间梨果MT含量的降低（图2A）。储存12天后，MT处理梨果的MT含量比对照组高9.87%。对照组梨果中TDC活性在最初2天上升，随后从第2天到第10天下降，之后略有回升（图2B）。T5H活性从第0天到第6天下降，随后在对照组梨果中回升（图2C）。对照组梨果中SNAT活性在储存最初2天升高，之后逐渐下降；ASMT和COMT活性在前4天急剧下降，随后从第4天到第12天缓慢回升（图2D-F）。相比之下，与对照组相比，MT在储存期间显著提高了梨果中TDC、T5H、ASMT和COMT的活性。储存第12天后，MT处理梨果中TDC、T5H、ASMT和COMT的活性分别比对照组高约14.91%、33.39%、39.11%和21.08%。

 

**图2. MT处理激活了库尔勒香梨的内源性MT生物合成。** （A）MT含量的变化。（B-F）香梨中TDC、T5H、SNAT、ASMT和COMT活性的变化。（G-I）香梨中PbSNAT2、PbASMT和PbCOMT1表达的变化。（J）梨果中PbCANDs的热图。（K）香梨中PbCAND2的表达。竖线表示均值的SD（n = 3）。两组之间的统计学显著差异（P < 0.05）通过独立t检验评估，并以不同字母标记。

梨果中PbSNAT2、PbASMT和PbCOMT1的转录模式分析如图2G-I所示。MT在储存第2天至第6天上调了梨果中PbSNAT2、PbASMT和PbCOMT1的表达，而在储存后期抑制了这些基因的表达，表明MT在储存早期起到激活剂的作用。这些发现表明，MT的应用能有效激活MT生物合成酶活性和基因表达，在炭疽病感染过程中增强梨果中的内源性MT水平。此外，鉴于MT受体在植物应激条件下传递MT信号的关键作用，我们通过转录组分析和qRT-PCR鉴定了库尔勒香梨果实在病害发展过程中响应外源MT的关键MT受体。转录组差异表达的褪黑素受体PbCANDs热图如图2J所示。除PbCAND7（ncbi_103950696）的表达被MT下调外，其余PbCAND7（ncbi_103932971）、PbCAND7（ncbi_103933781）、PbCAND7（ncbi_125469378）、PbCAND2（ncbi_103934030）、PbCAND2（ncbi_125479683）和PbCAND2（ncbi_125469953）基因均被MT处理上调。进一步检测了PbCAND2的表达，如图2K所示，其表达量从第0天到第4天上升，随后从第6天到第12天下降。与对照组相比，MT在储存早期显著诱导了梨果中PbCAND2的转录，储存第4天时，MT处理梨果中PbCAND2的表达是对照组的17.32倍。基于上述发现，我们选择受体PbCAND2（ncbi_125469953）进行后续分析。

## 3.5 梨PbCAND2的进化分析、分子对接、序列比对和亚细胞定位

如图3A所示，进化分析表明PbCAND2属于CAND基因家族，并与拟南芥（*Arabidopsis thaliana*）中的AtCAND8/2具有强同源性。

根据PbCAND2受外源褪黑素诱导且与褪黑素信号通路相关的结果，分子对接进一步预测了梨果实中褪黑素与PbCAND2之间潜在的结合位点。结果显示，褪黑素与PbCAND2之间具有显著的结合亲和力，结合能为?5.26 kcal mol?1。该相互作用主要由范德华力驱动（范德华力/氢键脱溶剂化能：?6.36 kcal mol?1），并通过与PbCAND2的PRO11和PHE38残基形成氢键而稳定，键长分别为2.0 ?和2.1 ?（图3B）。负结合能支持了褪黑素-PbCAND2复合物的自发性和稳定性。序列比对显示，PbCAND2含有7个跨膜结构域（TM），并在N端具有预测的褪黑素结合位点（图3C），表明它是一种跨膜蛋白，可以通过结合褪黑素发挥功能。激光共聚焦观察显示，PbCAND2定位在烟草叶片的细胞膜上（图3D），表明PbCAND2可能在细胞质或膜水平的代谢功能中发挥重要作用。

下载：下载高分辨率图像（1MB） 下载：下载全尺寸图像

图3. 梨PbCAND2的系统发育树分析（A）、分子对接（B）、氨基酸序列比对（C）和亚细胞定位（D）。在序列比对中，CAND2的褪黑素结合位点用红色实心圆标记，PRO11和PHE38跨膜结构域用红色方框突出显示。亚细胞定位图像中的标尺代表10 μm。

**3.6 梨果实贮藏期间Ca2?分布、CAM和CML含量的变化**

如图4A所示，在整个0天、2天、6天和12天的贮藏期间监测了梨细胞中的Ca2?分布。在第0天，对照果实细胞中的游离Ca2?水平相对较低。然而，在贮藏2天、6天和12天后观察到Ca2?荧光强度增加。相比之下，褪黑素处理的梨细胞在贮藏期间表现出明显更强的胞内Ca2?荧光，表明在灰葡萄孢菌感染条件下，褪黑素可以刺激梨中的Ca2?内流。

下载：下载高分辨率图像（413KB） 下载：下载全尺寸图像

图4. 外源褪黑素处理对梨果实贮藏期间Ca2?分布（A）、CAM含量（B）和CML含量（C）的影响。垂直误差线表示均值的SD（n=3）。不同字母表示对照组与褪黑素处理组之间在P<0.05水平上的显著差异。Ca2?分布图像中的标尺代表10 μm。

梨果实中CAM的含量在贮藏初期呈上升趋势，随后下降（图4B）。从贮藏第0天到第2天，褪黑素处理的果实维持了比对照更高的CAM水平，在第2天达到峰值。然而，从第2天到第12天，其值低于对照组（图4B）。与CAM不同，褪黑素处理的果实从贮藏第0天到第8天CML含量低于对照。相反，从第10天到第12天发现了相反的趋势（图4C）。这些发现表明，褪黑素不仅诱导梨果实中的Ca2?内流，还调节钙调蛋白和钙调蛋白样蛋白的含量。

**3.7 与褪黑素缓解梨果实病害相关的全局转录组动态**

为了进一步揭示褪黑素如何抑制梨果实的黑斑病，应用RNA-Seq技术研究了褪黑素处理后梨果实的转录变化。成功构建了21个cDNA文库，每个文库产出35,344,868至48,325,242条干净reads。Q20和Q30评分分别超过95.59%和92.62%，GC含量范围为45.67–46.25%。这些参数共同表明转录组数据质量高，足以可靠地用于下游分析（补充表S3）。利用单个样品的FPKM值进行了相关分析和主成分分析（PCA）以评估样本可重复性。如图5A所示，PCA结果显示所有生物学重复聚集成一组，各组之间具有明显的分离，大致分为七个聚类。样本间相关性热图显示每组内重复样本之间具有高度相关性（图5B）。此外，小提琴图显示基因表达丰度总体良好，两组均呈现平均分布（图5C）。根据FPKM值，13个成对比较中鉴定到的差异表达基因（DEGs）数量总结如下（上调/下调）：对照-2天 vs 褪黑素-2天（1084，367/717）；对照-6天 vs 褪黑素-6天（767，275/492）；对照-12天 vs 褪黑素-12天（803，437/366）；0天 vs 对照-2天（8655，4800/3855）；0天 vs 对照-6天（9843，4650/5193）；0天 vs 对照-12天（11,115，5087/6028）；对照-2天 vs 对照-6天（1591，691/900）；对照-2天 vs 对照-12天（5598，2035/3563）；对照-6天 vs 对照-12天（3378，1411/1967）；0天 vs 褪黑素-2天（7918，4595/3323）；0天 vs 褪黑素-6天（9157，4604/4553）；以及另一个比较（0天 vs 褪黑素-12天）产生了10,655个DEGs（4997/5658）（图5D）。图5E所示的文氏图展示了共享DEGs以及特异DEGs。在12个比较组中共鉴定出6个DEGs（图5E），认为它们与梨在贮藏期间的病害发生密切相关。进一步对12个组中DEGs进行KEGG富集分析表明，DEGs主要富集在代谢途径、次级代谢生物合成、淀粉和蔗糖代谢、碳代谢和类固醇生物合成等途径中（图5F），表明这些途径可能在褪黑素抑制梨果实病害中发挥重要功能。

下载：下载高分辨率图像（490KB） 下载：下载全尺寸图像

图5. 贮藏期间褪黑素处理梨果实的转录组分析。（A）所有样本的主成分分析（PCA）。（B）所有样本间成对相关性的热图。（C）各组间基因表达丰度的小提琴图。（D）来自不同比较组合的DEGs火山图。（E）比较组间共享和特异DEGs的文氏分析。（F）DEGs的KEGG富集分析。

**3.8 与褪黑素诱导梨果实抗病相关的基因模块鉴定**

对8000个DEGs进行了WGCNA分析，以更深入地了解与褪黑素赋予抗病相关的转录网络。随后分析了鉴定到的模块与病害相关指标之间的相关性（图6A）。模块-性状关系显示，蓝色模块（r=0.89，P=5.3×10??，r=0.88，P=1.1×10??，r=-0.8，P=1.5×10??，r=-0.49，P=2.3×10?2）与病斑直径和病害指数呈正相关，但与褪黑素含量和PbCAND2表达呈负相关。相比之下，绿松石色和黄色模块与褪黑素含量和PbCAND2表达呈正相关，系数分别为0.8（P=1.2×10??）、0.83（P=4×10??）、0.74（P=1.2×10??）和0.53（P=1.3×10?2）（图6B）。因此，选择蓝色、绿松石色和黄色模块作为目标模块，将这三个模块中的基因视为参与调节梨中褪黑素介导病害缓解的候选基因。进一步使用KEGG富集分析探索目标模块中关键基因的潜在功能。候选基因主要富集在碳水化合物、氨基酸、脂质、能量和次级代谢物产生相关的代谢途径中（图6C）。考虑到Ca2?信号可能与褪黑素信号相互作用并调节病原胁迫下果实中下游的生理代谢，我们进一步基于WGCNA分析鉴定了Ca2?信号通路的关键候选基因。如图6D所示，从蓝色、绿松石色和黄色模块中鉴定了55个Ca2?信号相关基因，其中钙结合蛋白PbCBP1-like（ncbi_103965952）、PbCBP60A-like（ncbi_125478936）、PbCIPK25（ncbi_103938979）、PbCIPK5（ncbi_103953715）、PbCIPK11（ncbi_103945799）、PbCML36（ncbi_125467814，ncbi_125468668，ncbi_125474047）、PbCML7（ncbi_103953910）、PbCML3（ncbi_125467867）、PbCML29（ncbi_103956977）、PbCPK32（ncbi_103963078）、PbCPK17（ncbi_103960516）、PbCPK10（ncbi_103958770）、钙调蛋白结合转录激活因子4（PbCAMTA4）（ncbi_103935121）、环核苷酸门控通道4-like（PbCNGC4-like）（ncbi_125468434）、钙敏感受体（PbCAS）（ncbi_103949034）、钙通透阳离子通道1（PbCSC1）（ncbi_103948291）、PbCAMTA2（ncbi_103961240）、PbCAMTA5（ncbi_103959324）、PbCPK13（ncbi_103930546）、PbCPK7-like（MSTRG.28681）、PbCPK11（ncbi_103964115）、PbCBP25（ncbi_103962332）、谷氨酸受体样蛋白3.3（PbGLR3.3）（ncbi_103961739）、PbCNGC17（ncbi_103967902）、PbCIPK8-like（ncbi_125475991）、PbCIPK8（ncbi_103956163）、PbCIPK10-like（ncbi_103958952）、PbCIPK3（ncbi_103938719）、PbCIPK6-like（ncbi_103956070）、PbCIPK2-like（ncbi_125467835）、PbCML21（ncbi_103967579）、钙-脂质结合蛋白（PbCLB）（ncbi_103967724）、跨膜和卷曲螺旋结构域1（PbTMCO1）（ncbi_103958714）在贮藏2天、6天或12天时被褪黑素上调，而PbCPK26（ncbi_103933311）、PbCIPK23（ncbi_103951310）、钙转运ATP酶（PbCLAC）（ncbi_103934222）、PbCPK4（ncbi_103951600）、PbCPK11（ncbi_103937716）、PbCPK2（ncbi_103948173，ncbi_103951220）、PbCBP60B-like（ncbi_125470901）、PbGLR3.7-like（ncbi_125474899）、PbGLR3.6（ncbi_103950175）、PbCNGC15b（ncbi_103962021）、PbCNGC5（ncbi_103949065）、PbCIPK2（ncbi_103961186）、PbCIPK1（ncbi_103950326）、PbCIPK4（ncbi_103940575，ncbi_103929775）、双孔通道1（PbTPC1）（ncbi_103948547）、PbCML22（ncbi_103963501）、PbCML16（ncbi_103946844）、PbCML27（ncbi_103950582）在贮藏2天、6天或12天时被褪黑素处理下调，表明这些Ca2?信号相关基因可能在蜕黑素赋予库尔勒香梨抗病性中发挥关键作用。因此，这些候选基因被用于构建后续的共表达网络。

下载：下载高分辨率图像（739KB） 下载：下载全尺寸图像

图6. 梨果实对褪黑素处理的WGCNA分析。（A）通过DEGs层次聚类生成的聚类树状图。（B）基因模块与表型性状之间相关性的热图及相应P值。从红色到紫色的颜色梯度反映各模块与病害相关指标之间的正相关和负相关，括号内的值表示P值。（C）对蓝色、绿松石色和黄色模块中DEGs进行KEGG富集分析。（D）Ca2?信号相关基因的热图。

**3.9 梨果实褪黑素诱导抗病性背后的调控网络**

基于上述分析结果，我们选择碳水化合物代谢、氨基酸代谢和次级代谢物生物合成途径，进一步构建Ca2?信号、转录因子和代谢途径之间的共表达调控网络。首先，对55个Ca2?信号相关基因与从WGCNA的3个目标模块中鉴定到的共20个差异表达转录因子（TFs）进行了Pearson相关分析。基于|PCC|>0.88的阈值，筛选出13个TFs和39个Ca2?信号相关基因用于后续分析。对这13个TFs（PbbHLH51、PbNAC083、PbCPRF1、PbATHB-7、PbZAT9、PbZAT12-like、PbZHD11、PbERF060、PbNAC047、PbSCL14、PbARF18-like、PbMADS7和PbMYB44-like）进一步进行了TFBS富集分析。结果显示PbbHLH51、PbNAC083、PbCPRF1、PbATHB-7、PbZAT9、PbZAT12-like、PbZHD11、PbERF060、PbNAC047、PbSCL14、PbARF18-like、PbMADS7和PbMYB44-like富集在DNA结合位点，如cCACGTGm和CACGTGm、wyACGyAAcc和yACGyAA、TGCCACGTsasmwwh、sACGTGGCAww和ACGTGGCA、yCAATCAWtg、tcAATGATTGrwt和tcAATGATTGr、yTACTwmw和yTACTw、yywhyyTCACTcthh和TCACTct、wwCAATTATTGdw和CAATTATTG、crCCGaCmaw和crCCGaCm、wwhwaYACGtmwcyt和aYACGtmwcy、wwwwwTdACCGTTrr、wwcTAACGGTcaw和TAACGGTc、RCCGACAw和RCCGACA、hwtwCCAwWwwTrGwAak和CCAwWwwTrGwAa、TAACbGwawww、whAACGGTcAww和AACGGTcA（图7A；补充表S6）。此外，我们对13个选定的TFs与从WGCNA的三个目标模块中鉴定到的参与碳水化合物代谢、氨基酸代谢和次级代谢物生物合成的56个结构基因进行了Pearson相关分析。基于|PCC|>0.88的阈值，筛选出33个上述代谢途径中的结构基因。利用FIMO工具（MEME Suite平台中集成的功能工具）完成了33个碳水化合物代谢、氨基酸代谢和次级代谢物生物合成相关基因以及13个TFs的2000 bp上游启动子序列中顺式作用调控元件的扫描。图7A和补充表S7展示了与13个TFs（PbbHLH51、PbNAC083、PbCPRF1、PbATHB-7、PbZAT9、PbZAT12-like、PbZHD11、PbERF060、PbNAC047、PbSCL14、PbARF18-like、PbMADS7和PbMYB44-like）TFBS匹配的顺式作用元件。这些元件在梨中参与碳水化合物代谢、氨基酸代谢和次级代谢物生物合成的33个基因的启动子中被鉴定到。结果显示，13个TFs的TFBS可在32个代谢相关基因（除PPCC外）的启动子区域中被检测到（图7A；补充表S7），表明这些结构基因可能是这13个TFs的靶基因。

下载：下载高分分辨图像（635KB） 下载：下载全尺寸图像

图7. 梨果实褪黑素介导病害缓解的底层调控网络。（A）13个靶标代谢相关基因的TFs及潜在TFBS。（B）Ca2?信号、TFs和关键代谢途径之间的调控网络。

随后，我们建立了与Ca2?信号转导相关的基因、TFs以及参与氨基酸、碳水化合物代谢和次级代谢物生物合成的结构基因之间的调控网络（图7B；补充表S4、S5）。

基于上述 Pearson 相关系数（PCC）结果，筛选出 39 个涉及 Ca2+ 信号通路的差异表达基因（DEGs），包括 PbCNGC5/15b/17、PbGLR3.6/3.3/3.7-like、PbTPC1、PbCSC1、PbCML29/16/36/22、PbCIPK10-like/8/6-like/23/4/25/3/8-like/2-like/2、PbCLB、PbCPK10/4/2/26/11/32/17、PbCAMTA4/5/2 以及 PbCBP60A-like/60B-like/25，这些基因与 13 个差异表达转录因子（TFs）强共表达，包括 PbbHLH51、PbNAC083、PbCPRF1、PbATHB-7、PbZAT9、PbZAT12-like、PbZHD11、PbERF060、PbNAC047、PbSCL14、PbARF18-like、PbMADS7 和 PbMYB44-like（|PCC| > 0.88）。随后，这 13 个 TFs 与涉及氨基酸代谢的 33 个结构基因强共表达，包括支链α-酮酸脱氢酶（PbBCDH）、天冬氨酸氨基转移酶 2（PbL-ASP2）、阳离子氨基酸转运体 8（PbCAT8）、半胱氨酸合成酶样蛋白（PbCYSD1）、吲哚 -3-丙酮酸单加氧酶 YUCCA6（PbYUC6）、谷胱甘肽水解酶 1 亚型 X1（PbGGT1）以及阳离子氨基酸转运体 1 样蛋白（PbCAT1）；碳水化合物代谢相关基因，包括果胶乙酰酯酶 8（PbPAE8）、果胶甲酯酶（PbPME）、β-葡萄糖苷酶 BoGH3B（Pbβ-Glu）、推测的β-D-木糖苷酶（PbBXL1）、可能的果胶酯酶/果胶酯酶抑制剂 20（PbPME20）、乙醛酶 I（PbGLO1）以及磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶 2（PbPPCC）；以及次生代谢产物生物合成相关基因，包括卫矛醇还原酶（PbSALR）、NADPH 依赖性醛还原酶样蛋白（PbChIADR）、角鲨烯单加氧酶 SE1（PbSQE1）、环外二醇环裂解双加氧酶样蛋白（PbLIGB）、9-顺式环氧类胡萝卜素双加氧酶 NCED2（PbNCED2）、可能的肉桂醇脱氢酶 6（PbCAD6）、对苯二酚葡萄糖基转移酶样蛋白（PbAS）、推测的 UDP-葡萄糖黄酮 3-O-葡萄糖基转移酶 3（PbUFGT3）、UDP-糖基转移酶 73B6（PbUGT73B6）、多酚氧化酶（PbPPO）、周期昼夜节律钟 3（PbPER3）、1-氨基环丙烷 -1-羧酸氧化酶 1（PbACO2）、可能的 1-脱氧 -D-木糖 -5-磷酸合酶（PbKTK2）、脱镁叶绿素 a 加氧酶（PbCAO）、(+)-新薄荷醇脱氢酶样蛋白（PbSDR1）、过氧化物酶 12（PbPER12）、过氧化物还原蛋白 -2F（PbPRXIIF）以及推测的葡萄糖醛酸基转移酶（PbPGSIP8）（|PCC| > 0.88）。在这 33 个代谢相关 DEGs 中，PbYUC6、PbBCDH、PbCAT1、PbL-ASP2、PbGLO1、PbPPCC、PbPAE8、PbPME、PbPPO、PbPER3、PbACO2、PbSQE1、PbTKT2、PbCAO、PbNCED2、PbCAD6、PbPGSIP8 的表达经 MT 处理后上调。相比之下，PbGGT1、PbCAT8、PbCYSD1、Pbβ-Glu、PbPME20、PbSALR、PbChIADR、PbSDR1、PbSQE1、PbLIGB、PbPER12、PbPRXIIF、PbAS、PbUFGT3、PbUGT73B6 的转录水平经 MT 处理后下调，而 PbBXL1 的表达在梨果实 2 天时被 MT 激活但在 12 天时受到抑制。综上所述，这些发现表明 MT 诱导梨果实抗病性主要归因于 Ca2+ 信号、TFs 和涉及关键代谢通路（氨基酸、碳水化合物和次生代谢产物生物合成）的结构基因（SGs）之间的级联调控关系。

3.10. PbCAND2-PbCML29 和 PbCAND2-PbCIPK4 的分子对接分析
遵循上述发现，我们选择了两个经 MT 处理显著调节的 Ca2+ 结合蛋白（PbCML29 和 PbCIPK4），并与褪黑素受体 PbCAND2 进行分子对接，以调查 PbCAND2 与这些蛋白之间是否存在潜在相互作用。从它们的晶体结构构建了 PbCAND2、PbCML29 和 PbCIPK4 异源二聚体的 3D 模型，从而能够预测构象变化并识别相互作用相关残基。PbCAND2-PbCML29 复合物的整体结构由两个氢键稳定，键长分别为 2.9 ? 和 3.4 ?，分别由 PbCML29 的 SER136 和 ARG25 残基与 PbCAND2 的 GLY184 和 TYR162 残基形成（图 8 A）。PbCAND2-PbCML29 复合物的结构洞察表明，PbCAND2 可能通过氢键与 PbCML29 相互作用。同样，PbCAND2-PbCIPK4 复合物如图 8B 所示。该复合物由 4 个氢键稳定，PbCIPK4 的 GLU295、LYS251、GLN239 和 TYR198 残基与 PbCAND2 的残基包括 ARG2、HIS244、THR223 和 TYR219 形成氢键。例如，PbCIPK4 的 GLU295、LYS251、GLN239 和 TYR198 通过 2.7 ?、2.8 ?、3.1 ? 和 2.5 ? 的氢键分别与 PbCAND2 的 ARG2、HIS244、THR223 和 TYR219 接触。PbCAND2-PbCIPK4 复合物的结构洞察也表明，PbCAND2 可能通过氢键与 PbCIPK4 相互作用。
图 8.（A）PbCAND2-PbCML29 和（B）PbCAND2-PbCIPK4 复合物的分子对接分析。

3.11. RNA-Seq 结果的验证
为了确认 RNA-Seq 获得的可靠性，我们随机选择了 12 个代表性 DEGs（PbABCC3、PbAFS1、PbATL42、PbCML30、PbNAC081、PbHSP26.5、PbOPT3、PbPME20、PbRAP2–3、PbSRG1、PbTGA7、PbWRKY29）进行 qRT-PCR（补充图 S3）。相关性分析显示 RNA-Seq 和 qRT-PCR 数据之间高度一致（R2 = 0.7884）（补充图 S4），这证实了 RNA-Seq 结果的可靠性。

4. 讨论
A. alternata 引起的黑斑病是一种主要真菌病害，导致‘库尔勒’香梨腐烂并造成巨大的经济损失（Sun 等，2025）。越来越多的证据表明，在采后园艺领域，外源 MT 应用可以提高抗真菌感染能力，如葡萄柚（Zhou 等，2025）、猕猴桃（Liu 等，2026）、芒果（Xiang 等，2025）。在梨中，早期研究证实外源 MT 可以通过激活抗氧化防御反应、苯丙烷代谢和病程相关蛋白来诱导对 A. alternata/Botryosphaeria dothidea 入侵的抗病性（Xiang 等，2022a，Xiang 等，2022b，Xu 等，2024）。与这些发现一致，我们的结果显示，在 A. alternata 感染后，0.20 mmol L?1 MT 处理显著抑制了香梨中黑斑病的发生、病斑直径和病情指数（图 1）。此外，我们的研究还获得了 0.10–0.40 mmol L?1 MT 对 A. alternata 体外孢子萌发和菌丝生长无抑制影响的结果（补充图 S1），暗示 MT 赋予梨果实的黑斑病控制可能是由于抗病性诱导而非对病原体的直接毒性。Xiang 等（2022a）在梨果实中也报道了类似的结果。众所周知，采后水果和蔬菜可以通过调节涉及次生代谢产物和病程相关蛋白（PRs）合成的防御酶活性来获得抗病原体胁迫的能力（Sui 等，2026）。在本研究中，MT 显著激活了 PAL、C4H、4CL、CHI、CAD 和 GLU 的活性，并提高了香梨中酚类化合物的水平，伴随着 MT 处理果实病斑直径和病情指数的降低（图 1）。Wang 等（2023）也在其关于 MT 诱导苹果对扩展青霉抗性的研究中获得了类似结果。相应地，苯丙烷代谢、PRs（GLU、CHT）相关的较高活性水平和表达水平，以及较高的酚类化合物水平有利于增强香梨对 A. alternata 感染的抗性（Sun 等，2025，Yang 等，2024）。整体而言，这些发现表明 MT 可以高效诱导香梨对 A. alternata 入侵的抗性，但潜在的分子机制仍需进一步探索。

最近的证据揭示，MT 不仅参与调节涉及植物病原体防御的各种生理和代谢过程，还可以被 CAND2/PMTR1 识别，触发下游级联反应，并在植物免疫反应中作为信号分子发挥至关重要的作用（Hao 等，2025，Chen 等，2025）。褪黑素的信号功能通常需要与其他信号分子相互作用。其中，Ca2+ 信号作为关键的第二信使，与褪黑素协同工作形成复杂的调控网络，在褪黑素调节植物防御应激反应中发挥重要作用。例如，Vafadar 等（2021，2020）发现 MT 可以激活细胞质游离钙（[Ca2+]cyt）增加以及 Ca2+/钙调蛋白（CAM）与 MT 之间的相互作用，有助于调节离子通透性和抗氧化能力，从而增强植物的耐盐性。在黄瓜幼苗中，MT 可以上调 Ca2+ 通道蛋白 CNGCs 和 Ca2+ 传感器 CPKs 的表达以刺激 Ca2+ 信号，从而减轻低温胁迫下的生长抑制（Ma 等，2024）。Wei 等（2018）观察到 MT 通过与 MT 受体 CAND2/PMTR1 结合刺激 H2O2 产生和 Ca2+ 内流，从而调节拟南芥的气孔关闭。同样，我们本工作中的数据也显示，MT 处理可以在储存期间激活库尔勒香梨细胞中的 Ca2+ 荧光强度，并在储存第 2 天和第 12 天分别增强了 CAM 含量和 CML 含量（图 4）。同时，MT 处理果实表现出较轻的黑斑病症状，暗示 Ca2+ 信号可能参与 MT 诱导的库尔勒香梨抗病防御。Zhang 等（2026）也发现，激活的 Ca2+ 内流和增强的钙调蛋白蛋白水平有助于减少 A. alternata 入侵后库尔勒香梨的黑斑病。此外，在本工作中，我们发现 MT 处理激活了褪黑素生物合成酶的活性和基因表达，以增强梨果实中的内源 MT 水平（图 2 A）。同时，我们通过转录组学和 qRT-PCR 分析鉴定了梨果实中关键的 MT 诱导褪黑素受体 PbCAND2，两者均证实 PbCAND2 被 MT 处理上调（图 2 J 和 K）。我们的生物信息学分析结果进一步显示，梨 PbCAND2 是一种膜蛋白，包含 7 个跨膜结构域（图 3）。分子对接显示 MT 与 PbCAND2 形成 2 个氢键，接触 MT 和 PbCAND2（图 3B）。MT 与 PbCAND2 之间的相互作用可能是增强库尔勒香梨抗病性的重要原因之一。在未来，仍需进一步验证实验以确认它们的直接结合效应和结合位点。同样，Kong 等（2021）也证实了两个褪黑素受体 trP47363 和 trP13076 可以识别 MT 及其同源物，并进一步刺激 PR1 表达和 SA 信号通路，从而诱导烟草对烟草疫霉感染的防御反应。这些观察为后续探索 PbCAND2 在香梨中的功能提供了基础。然而，PbCAND2 是否参与库尔勒香梨果实在疾病发展过程中 MT-Ca2+ 信号的串扰仍不清楚。因此，对 PbCAND2 介导的 MT 信号与 Ca2+ 信号之间的相互作用的进一步研究将有助于揭示负责 MT 刺激香梨防御反应的分子调控机制。

据记载，Ca2+ 特征可被 Ca2+ 传感器识别，进而结合靶蛋白（如离子转运体、转录因子、激酶、代谢酶等），激活下游磷酸化途径和转录反应，最终传递信号并使植物响应病原体感染胁迫（Wang 和 Luan，2024）。在这些靶蛋白中，转录因子可以特异性识别下游靶基因的顺式作用元件以调节其表达，它们在采后园艺作物抵御病原体的防御反应中作为关键调节因子，如 WRKYs、MYC2、ERFs、bZIPs 和 MaMYBs（Li 等，2025，Li 等，2024，Liu 等，2026，Zhang 等，2025）。重要的是，上述多个转录因子可以形成复杂的调控网络，与 Ca2+ 信号一起响应植物免疫（Zeng 等，2023，Deng 等，2025）。因此，阐明与 Ca2+ 信号通路共表达的转录因子对于理解香梨抗病性中 MT-Ca2+ 信号介导的下游分子网络具有重要意义。在本工作中，进行了加权基因共表达网络分析（WGCNA）以筛选参与 MT 信号调节抗病性的潜在 Ca2+ 信号通路，并进一步构建了 MT 调节的 Ca2+ 信号与其下游靶标之间的基因共表达网络（图 7）。具体来说，从与香梨疾病发展和 MT 信号相关性最高的三个模块（蓝色、绿松石色和黄色）中，鉴定出 55 个 Ca2+ 信号相关基因参与 MT 诱导的果实抗病性（图 6D）。其中，PbCBP1-like/60A-like/25、PbCIPK25/5/11/8-like/8/10-like/3/6-like/2-like、PbCML36/7/3/29/21、PbCPK32/17/10/13/7-like/11、PbCAMTA4/2/5、PbCNGC4-like、PbCAS、PbCSC1、PbGLR3.3、PbCNGC17、PbCLB 和 PbTMCO1 在储存期间的梨果实中被 MT 处理上调。在樱桃番茄果实中也发现了类似结果，其中 MT 诱导的病原抗性与其在触发 Ca2+ 信号相关基因（SlCPK）中的作用密切相关（Li 等，2022）。Zhang 等（2026）也表明，上调的 CNGCs、CAM1/7、CML46、CPK28、CBL4 和 CIPK14/21 参与了独脚金内酯增强的库尔勒香梨抗病性。此外，调控网络进一步显示 39 个 Ca2+ 信号通路相关基因（PbCNGC5/15b/17、PbCIPK10-like/8/6-like/23/4/25/3/8-like/2-like/2、PbCML29/16/36/22、PbCPK10/4/2/26/11/32/17、PbCAMTA4/5/2、PbGLR3.6/3.3/3.7-like、PbCBP60A-like/60B-like/25、PbTPC1、PbCSC1 和 PbCLB）与转录因子如 PbbHLH51、PbNAC083、PbCPRF1、PbATHB-7、PbZAT9、PbZAT12-like、PbZHD11、PbERF060、PbNAC047、PbSCL14、PbARF18-like、PbMADS7 和 PbMYB44-like 强共表达（图 7B）。

PbCML36、PbCSC1、PbCIPK8、PbCAMTA2、PbCPK32、PbCPK11、PbCNGC17、PbCIPK3、PbCIPK6-like、PbCAMTA5/4、PbGLR3.3、PbCBP25、PbCIPK2-like、PbCIPK8-like、PbCBP60A-like、PbCIPK25、PbCPK10、PbCPK17和PbCLB的转录，以及转录因子（PbCPRF1、PbATHB-7、PbZAT9、PbMYB44-like、PbZHD11、PbARF18-like、PbMADS7和PbERF061-like）的表达被MT处理上调，而PbCIPK4、PbTPC1、PbCML16、PbCNGC5、PbGLR3.6、PbCPK2、PbCPK4、PbCIPK2、PbCNGC15b、PbCML22、PbCBP60B-like、PbGLR3.7-like、PbCPK26、PbCIPK23以及转录因子（PbbHLH51、PbNAC083、PbZAT12-like、PbERF060、PbNAC047和PbSCL14）的表达被MT处理下调，同时MT处理的香梨表现出降低的疾病症状，表明MT诱导香梨增强抗真菌感染防御的部分原因是其调节Ca2+信号与多种转录因子之间串扰的功能。与我们的发现类似，Yuan等（2021）证实Ca2+-CaM2可与AtSR1/CAMTA3相互作用，从而限制AtSR1/CAMTA3对NPR1的转录抑制，最终赋予拟南芥抗病性。此外，一种CML蛋白（TCH3）可与CPK5结合，促进CBP60g转录因子的磷酸化，进而促进CBP60g对与病原防御相关基因的调控，从而刺激拟南芥对大丽轮枝菌（V. dahliae）的防御（Sun等，2022）。Cheng等（2016）观察到大丽轮枝菌感染可触发棉花细胞中的Ca2+内流，且GhCML11与GhMYB108相互作用，诱导对大丽轮枝菌入侵的防御。在木薯中，MeCDPK1磷酸化MeHSP90.9，促进MeWRKY20在转录水平上对MePBS3和MeASMT2基因的激活，从而抵御病原感染（Wei等，2024）。结合我们的发现与其他人的前期研究成果，可以推断Ca2+信号相关基因可能与多种转录因子相互作用，进一步调节下游靶基因的表达以应对MT处理香梨中轮枝菌（A. alternata）的入侵防御，但这些转录因子所调控的具体代谢通路仍需深入研究。次生代谢物在果实防御中的作用，主要是酚类化合物、类黄酮和木质素，它们不仅作为生化屏障抵御病原感染，还能诱导反应（在激发子识别后触发）（Alkan和Fortes，2015）。已充分证实次生代谢物来源于苯丙烷代谢及其支路途径，在园艺作物中由一系列关键基因（包括PAL、C4H、4CL、HCT、CCoAOMT、CCR、CAD、CHS、CHI、F3H、DFR和ANS）协同调控（Hou等，2025；Huang等，2023）。在梨果中，大量研究表明苯丙烷代谢相关基因的上调，如PbPAL、Pb4CL、PbC4H、PbLAC、PbPOD3、PbHCT、PbCOMT、PbF5H和PbCCoAOMT，有助于加速酚类化合物和多种类黄酮的合成，以增强对轮枝菌感染的防御（Sun等，2025；Wang等，2026a）。本研究RNA-Seq分析表明，参与次生代谢物生物合成通路的基因，如PbPPO、PbPER3、PbACO2、PbSQE1、PbTKT2、PbCAO、PbNCED2、PbCAD6和PbPGSIP8的mRNA水平在MT处理后转录上调，这与MT处理梨中CHI、β-1,3-Glu、PAL、C4H、4CL和CAD酶活性升高以及总酚类和木质素含量增加相一致（图1D-K），从而有助于增强香梨对轮枝菌入侵的抗性。与早期发现一致，咖啡酸处理的"早酥"梨对黑星病的抗性提高源于酚类化合物积累的增加，这由苯丙烷代谢相关基因和酶活性的激活所驱动（Guo等，2024）。转录因子被广泛认为是调节下游结构基因的关键调控因子，从而在病原感染胁迫响应中增强采后果蔬中酚类化合物的生物合成。例如，Zhang等（2025）报道ZjWRKY55可与ZjCCoAOMT和ZjGAD的启动子结合，上调其表达，有利于激活苯丙烷代谢以抵抗采后枣果中轮枝菌的侵染。在桃果中，PpMYB308作为PpPAL1和Pp4CL5的正向调控因子，加速总酚类和总类黄酮的生物合成，从而增强对灰葡萄孢菌（R. stolonifer）感染的抗病性（Li等，2023）。在龙眼果中，DlERF98可与苯丙烷途径相关基因（包括DlPAL1、DlC4H、Dl4CL2、DlCCR1、DlCAD1和DlCCoAOMT1）结合，刺激其转录水平，作为水杨酸诱导的针对龙眼球座菌（Phomopsis longanae Chi）感染的抗性正向调控因子（Chen等，2026）。与前期发现一致，本研究的TFBS富集分析和调控网络也揭示了一共19个参与次生代谢物生物合成的结构基因（PbPPO、PbPER3、PbSALR、PbChIADR、PbACO2、PbSQE1、PbTKT2、PbCAO、PbSDR1、PbSQE1、PbLIGB、PbNCED2、PbCAD6、PbPER12、PbPRXIIF、PbAS、PbUFGT3、PbUGT73B6和PbPGSIP8）与转录因子（PbbHLH51、PbNAC083、PbCPRF1、PbATHB-7、PbZAT9、PbZAT12-like、PbZHD11、PbERF060、PbNAC047、PbSCL14、PbARF18-like、PbMADS7和PbMYB44-like）高度共表达（图7B），这些转录因子可与次生代谢物生物合成基因启动子上位点的顺式作用元件结合（图7A），从而在调控香梨次生代谢物生物合成中发挥重要作用。在该网络中，PbPER3、PbCAD6、PbPPO和7个转录因子（PbCPRF1、PbATHB-7、PbZAT9、PbMYB44-like、PbZHD11、PbARF18-like和PbMADS7）被MT以不同程度上调，这与MT处理香梨中较低的发病率相一致（图1A）。此外，转录因子（PbCPRF1、PbATHB-7、PbZAT9、PbMYB44-like、PbZHD11、PbARF18-like和PbMADS7）的表达与Ca2+信号相关基因（PbCSC1、PbTPC1、PbCIPK3/6-like/2/2-like/8-like/25/4/8、PbCML16/22、PbCNGC5/15b/17、PbGLR3.6/3.3/3.7-like、PbCPK2/4/32/11/26/10/17、PbCAMTA5/2/4和PbCBP25/60B-like/60A-like）高度关联，暗示转录因子对次生代谢物合成的调控作用可能进一步受Ca2+信号调节，从而影响其转录调控能力。这些结果与先前发现一致，即DcCML3/11与DcCAMTA3的相互作用可促进DcCAMTA3介导的DcPAL1、DcC4H和Dc4CL1的转录激活以及DcCAD1的抑制，从而正向调控苯丙烷途径以维持鲜切胡萝卜的品质（Zhang等，2024）。Hou等（2022）也证明EjCaM7与EjCAMTA3相互作用，该结合增强了EjCAMTA3对EjPOD64和EjLAC12-like基因的转录抑制，从而减少枇杷果在冷胁迫下木质素的沉积。这些观察共同表明上述转录因子介导的次生代谢物生物合成基因激活可能是MT-Ca2+信号诱导香梨抗病性的关键机制，为未来分子研究提供了新的线索。氨基酸作为果实的关键营养组分，据报道也参与了植物防御响应（Yao等，2025）。精氨酸（Arg）、谷氨酸（Glu）、脯氨酸、γ-氨基丁酸（GABA）和苯丙氨酸（Phe）等氨基酸既充当代谢中间体，又充当信号分子，因此在园艺作物防御响应的调控中发挥双重作用（Shang等，2026）。Glu在植物中是几种氨基酸的共同前体，包括谷氨酰胺（Gln）、脯氨酸（Pro）、Arg和GABA（Liao等，2022）。其中，Arg促进Pro和多胺的积累，而Pro和GABA则清除ROS并维持细胞膜完整性。此外，芳香族氨基酸（色氨酸、Phe、酪氨酸）在植物中可转化为各种次生代谢物，包括生长素、吲哚生物碱和酚类化合物（Hildebrandt等，2015）。大量研究揭示了氨基酸稳态的调控与采后园艺作物抗病性增强的关系，如柑橘果（Duan等，2024；Xu等，2024）和番茄果（Sun等，2019；Wang等，2026）。在梨果中，先前的研究表明外源氨基酸（如L-谷氨酸（L-Glu）、L-赖氨酸、Phe）处理可通过调节各种信号分子、代谢途径和防御相关蛋白增强抗病性，同时它们还可激活各种内源氨基酸（包括Glu、GABA和Arg）的积累以增强抗病原菌能力（Jin等，2019；Li等，2024b；Liu等，2021）。然而，采后梨果中响应病原感染的氨基酸代谢相关基因以及控制其表达的上游调控因子仍不清楚。在本研究中，与氨基酸代谢相关的基因（PbYUC6、PbBCDH、PbCAT1、PbL-ASP2、PbGGT1、PbCAT8和PbCYSD1）在梨果中受MT处理显著调控，其中PbYUC6、PbBCDH、PbCAT1和PbL-ASP2的表达被MT上调，而PbGGT1、PbCAT8和PbCYSD1的转录水平被MT抑制。进一步的TFBS和调控网络分析显示，这些氨基酸代谢相关基因的启动子中含有PbbHLH51、PbNAC083、PbCPRF1、PbATHB-7、PbZAT9、PbZAT12-like、PbZHD11、PbERF060、PbNAC047、PbSCL14、PbARF18-like、PbMADS7和PbMYB44-like等转录因子的多个顺式作用元件（图7A；补充表S7）。此外，这些氨基酸代谢相关基因与这13个转录因子高度共表达，而这些转录因子又受PbCNGC5/15b/17、PbCIPK10-like/8/6-like/23/4/25/3/8-like/2-like/2、PbCML29/16/36/22、PbCPK10/4/2/26/11/32/17、PbCAMTA4/5/2、PbGLR3.6/3.3/3.7-like、PbCBP60A-like/60B-like/25、PbTPC1、PbCSC1和PbCLB的调控（图7B），表明Ca2+结合蛋白可与转录因子形成复合物，协同调控香梨中与氨基酸代谢相关的基因。类似地，Zhang等（2023）报道非蛋白氨基酸（GABA）生物合成相关基因（DcGAD和DcGABA-T）受DcCaM7-DcCAMTA6模块协同激活，以提高鲜切胡萝卜的品质。在鲜切甜瓜中，CmCML11可与CmCAMTA5结合并激活GABA支路中CmGAD1、CmGABA-T和CmSSADH的转录，以增强果实品质（You等，2024）。因此，上述发现表明参与氨基酸代谢的结构基因可能是Ca2+结合蛋白-转录因子模块的靶点，为未来研究MT诱导香梨抗病性的机制提供了方向。采后园艺作物的碳水化合物代谢主要涉及淀粉转化为糖，随后进一步转化为可溶性糖（如蔗糖、果糖和葡萄糖）及其相关衍生物，如山梨醇（Li等，2024a）。糖类不仅在植物防御响应中作为细胞能量前体，还与免疫信号分子相互作用（Yamada和Mine，2024）。已证实糖类在果实-病原菌相互作用中至关重要，防御预备状态通常伴随可溶性糖水平的升高（Wang等，2026b；Zhu等，2024）。糖水平的变化受一套与碳水化合物代谢相关的酶和基因（如SPS、SS、INV、AMY和BMY）调控。例如，海藻糖通过触发AMY活性和MdAMY转录水平，促进淀粉和可溶性糖的降解，从而增强苹果果的抗病性（Li等，2022）。ΔPePacC诱导NI、AI、SS和SPS，促进蔗糖向果糖和葡萄糖的转化；同时，ΔPePacC还通过上调SUT、TMT、vGT和SWEET的转录刺激糖转运，部分促进了苹果果抗病性的提高（Zhu等，2024）。在本研究中，参与碳水化合物代谢的基因（如PbGLO1、PbPPCC、PbPAE8和PbPME）的转录水平被MT处理上调，这与MT处理果实中较低的发病率一致，表明这些基因可能在调节香梨对链格孢菌（Alternaria alternata）的防御响应中发挥关键作用。类似地，也有研究发现MT通过调节拟南芥的碳水化合物代谢增强了对丁香假单胞菌（Pseudomonas syringae）感染的防御（Zhao等，2015）。此外，转录因子是控制抗病感染中糖合成或信号下游基因的关键调控因子。先前的研究表明β-氨基丁酸通过激活VvMYB44介导的蔗糖和苯丙烷代谢相关基因（SS2、SPS3、SPP1、UDPase3、AI、NI、STS1、PAL、4CL、C4H和CYP73A）的转录上调，在葡萄中诱发了针对灰葡萄孢菌（Botrytis cinerea）的预备防御（Li等，2021a）。在桃果中，PpWRKY40可直接结合PpSS1和PpSPS3基因启动其表达，从而促进可溶性糖积累以增强抗病性（Li等，2021b）。在番茄中，Pst DC3000诱导SlMYC2激活SlSUT2表达，导致糖外流以支持病原菌生长（Chen等，2026）。我们的进一步TFBS和调控网络分析揭示转录因子（PbSCL14、PbNAC083、PbMYB44-like、PbZAT12-like、PbCPRF1、PbATHB-7、PbZAT9、PbZHD11、PbERF060、PbARF18-like、PbMADS7和PbbHLH51）与碳水化合物代谢相关基因（包括PbGLO1、PbPPCC、PbPAE8、PbPME、PbBXL1、PbPME20和Pbβ-Glu）显著共表达（图7B）。这些结构基因的启动子中含有上述转录因子的多个结合位点（图7A），表明它们在香梨中的转录水平可能受这些转录因子的调控。

值得注意的是，这些转录因子本身与钙信号相关基因共同表达（图 7B），暗示钙信号 - 转录因子 - 碳水化合物代谢可能是褪黑素增强香梨抗病性的途径之一。然而，未来研究仍需进一步验证这种级联调控效应。先前的研究也证实，Ca2+-PpCDPK29 磷酸化 PpHSFA2a，从而增强其对下游靶基因（如 PpGSTU7、PpGSTU19、PpGolS1 和 PpBAM1）的转录激活，导致桃子果实响应冷胁迫时糖含量和抗氧化能力增加（Zhao 等，2025）。此外，最近的一项研究揭示，褪黑素受体 SlPMTR1/2 可与钙结合蛋白 SlCAM6 相互作用，激活 SlICE1-SlCBF1/SlCNGC2 模块，随后放大钙信号并提高番茄的抗寒性（Liu 等，2025）。这表明，褪黑素受体与钙信号相关蛋白之间的相互作用可能是褪黑素在植物中激活钙信号的关键机制之一，从而触发对胁迫反应的级联响应。CAND2/PMTR1 和钙传感器是参与这一复杂信号转导网络的关键组分。本研究的分子对接分析显示，褪黑素受体 PbCAND2 的残基 GLY184 和 TYR162 通过氢键与 PbCML29 的残基 SER136 和 ARG25 形成极性接触，而 PbCAND2 的残基 ARG2、HIS244、THR223 和 TYR219 分别通过氢键与 PbCIPK4 的残基 GLU295、LYS251、GLQ239 和 TYR198 形成极性接触（图 8）。这些发现表明，褪黑素受体 PbCAND2 与这两个钙结合蛋白（PbCML29 和 PbCIPK4）之间可能存在相互作用。综上所述，可以合理推测，香梨中褪黑素诱导的抗病性可能与 PbCAND2-钙信号串扰密切相关。该通路可能与多个下游转录因子相关联，这些转录因子协同调节次生代谢、氨基酸代谢和碳水化合物代谢，形成针对 A. alternata 感染的复杂调控网络，为未来的机制探索提供了新的见解和基础。然而，褪黑素 - 钙信号串扰的精确分子机制仍有待完全验证。未来研究仍需通过蛋白质相互作用实验（如酵母双杂交 Y2H、双分子荧光互补 BiFC、共免疫沉淀 Co-IP）验证 PbCAND2-PbCML29/PbCIPK4 相互作用，并通过转录实验（如双荧光素酶、凝胶迁移率变动试验 EMSA）验证转录因子介导的结构基因调控，从而为香梨中褪黑素诱导抗性的级联调控机制提供更多直接证据。

5. 结论
总体而言，施用褪黑素可以减轻黑斑病，并在香梨果实中维持较高水平的酚类化合物和与抗病防御相关的酶活性。同时，在链格孢菌（Alternaria alternata）感染后，褪黑素还触发了香梨果实中内源褪黑素的生物合成、PbCAND2 表达和钙信号。进一步的转录组学和 WGCNA 分析揭示，褪黑素通过 PbCAND2-钙信号级联介导的调控网络减轻梨果实病害，该网络涉及一系列关键的钙结合蛋白、转录因子和下游结构基因。此外，还发现 PbCML29 和 PbCIPK4 可能与 PbCAND2 相互作用，在香梨的褪黑素信号转导和下游代谢调节中发挥重要作用。根据上述结果，我们建立了褪黑素处理诱导香梨果实抗病的调控模型（图 9）。这些发现为梨果实病害发育潜在的分子调控过程提供了见解，并可能促进梨果实新型贮藏技术的发展。

下载：下载高分辨率图像 (618KB) 下载：下载全尺寸图像
图 9. 褪黑素介导梨果实抗病性增强的推测调控模型。红色箭头表示激活，蓝色箭头表示抑制。

CRediT 作者贡献声明
Mengyue Jiang：撰写 - 原稿、调查、数据整理。Wanyu Yan：撰写 - 原稿、调查。Lei Ma：调查。Hansen Wang：监督、数据整理。Jiacheng Hu：数据整理。Yu Wang：监督。Jingyang Hong：数据整理。Jun Xing：数据整理。Yating Zhao：监督、方法论、概念化。Yuanyuan Hou：撰写 - 审阅与编辑、监督、方法论、调查、概念化。

Mengyue Jiang|Wanyu Yan|Lei Ma|Hansen Wang|Jiacheng Hu|Yu Wang|Jingyang Hong|Jun Xing|Yating Zhao|Yuanyuan Hou