SfRop是通过调控AcMNPV病毒运输来控制斜纹夜蛾（Spodoptera frugiperda）的潜在靶标

《Pesticide Biochemistry and Physiology》：SfRop is a potential target for controlling Spodoptera frugiperda through regulation of AcMNPV viral trafficking

　　摘要Sec1/Munc18（SM）蛋白是调控SNARE复合体组装的上游核心调控因子。SM蛋白Rop在SNARE介导的膜融合中发挥关键作用，但其## 摘要Sec1/Munc18（SM）蛋白作为核心上游调控因子，负责调控SNARE复合体的组装。SM蛋白Rop在SNARE介导的膜融合中发挥关键作用，但其在杆状病毒感染中的功能在很大程度上仍未被探索。在此，我们证明，草地贪夜蛾（*Spodoptera frugiperda*）中的Rop同源蛋白SfRop对于草地贪夜蛾多角体病毒（AcMNPV）的感染周期至关重要。SfRop敲低显著降低了感染早期的病毒基因组复制、早期和晚期基因转录以及细胞内病毒基因组拷贝数。共聚焦显微镜显示，SfRop沉默阻碍了核衣壳向细胞核的转运，从而阻断了病毒进入。在感染晚期，SfRop缺失损害了子代病毒的释放，伴随GP64包膜蛋白在质膜上的定位减少以及出芽病毒颗粒在细胞内积累。相反，通过重组病毒过表达SfRop可增强子代病毒的产生。在机制上，SNARE基因*SfSyx1*和*SfSNAP25*的沉默与*SfRop*敲低的效果一致，而*SfRop*过表达部分挽救了缺陷，表明*SfRop-SfSyx1-SfSNAP25*在调控病毒复制中具有协同作用。重要的是，体内实验表明，*SfRop*敲低显著提高了AcMNPV攻毒后幼虫的存活率，突显了*SfRop*作为病毒传播关键宿主因子的作用。总之，我们的研究确立了*SfRop*作为AcMNPV进入和释放的关键调控因子，并表明靶向*SfRop*或其相互作用的SNARE伙伴可能是通过破坏病毒-宿主相互作用进行害虫防治的有前途的策略。## 引言囊泡内吞和外排依赖于多种功能蛋白的协调调控。SNARE（可溶性NSF附着蛋白受体）是一个蛋白质超家族，其成员负责分泌途径中几乎所有的融合事件，包括外排和内吞。其最显著的特征是含有SNARE结构基序。SNARE结构基序有四种不同的变体，即Qa、Qb、Qc和R。SNARE复合体的组装需要四种不同SNARE结构基序的参与，每个亚基贡献一个QabcR复合体。SM（Sec1/Munc18）蛋白家族是调控SNARE复合体功能的关键保守蛋白。SM蛋白是一种进化上保守的60-90 kDa可溶性外周膜蛋白，其序列折叠成拱形结构。SM蛋白可与SNARE蛋白相互作用，调控SNARE复合体的组装，从而介导囊泡运输。作为一类主要的运输蛋白，SM蛋白可进一步分为四个蛋白家族：Sec1/Munc18、Sly1、Vps33和Vps45。其中，Rop属于SM蛋白的Sec-1家族。Rop基因（Ras反向基因）最初位于果蝇*Ras2*基因上游，因其转录方向与*Ras2*基因相反而得名。果蝇中*Rop*的开放阅读框编码597个氨基酸，该蛋白高度亲水且无跨膜区。病毒入侵和复制涉及囊泡运输和膜融合等关键事件。病毒可操纵宿主的囊泡运输系统以促进自身组装、成熟和释放。在经典的SNARE膜融合循环系统中，SNARE蛋白是介导膜融合的核心分子。它们在NSF（ATP酶N-乙基马来酰亚胺敏感融合蛋白）及其辅因子SNAP（可溶性NSF附着蛋白）的催化下被解离，以回收SNARE用于新的融合事件，而SM蛋白参与调控SNARE复合体的组装。这些膜融合关键因子已被证明参与多种病毒的感染过程。在烟草花叶病毒（TuMV）感染烟草期间，SNARE家族蛋白Sec22的过表达会损害内质网和高尔基体之间运输囊泡的融合，从而增强病毒在细胞间扩散的能力。已确认SNAP25与狂犬病毒（RABV）糖蛋白G之间存在相互作用。在病毒从细胞释放阶段，SNAP25具有抑制作用。总之，狂犬病毒释放时必须利用宿主的SNAP25。当AcMNPV感染宿主细胞时，NSF功能的缺失将影响病毒感染过程。在病毒入侵过程中，NSF-DN导致进入细胞的病毒颗粒滞留在细胞质中，无法有效转运至细胞核；在病毒释放阶段，NSF-DN导致病毒包膜蛋白GP64在质膜上的分布显著减少，且部分子代核衣壳滞留在核周空间。SM蛋白也参与病毒感染。小鼠脑星形胶质细胞被小鼠脑脊髓炎病毒（TMEV）感染后，Munc-18的mRNA表达水平在感染早期（2小时）显著升高。邦纳病病毒（BDV）感染神经元后，干扰了蛋白激酶C（PKC）介导的磷酸化过程，导致Munc18-1/nSec1等关键调控蛋白的磷酸化水平降低，导致突触功能障碍并引起神经系统行为障碍。此外，也有报道EBV引起Munc18/STXBP突变。既往研究表明，包括NSF和转运体所需内体分选复合体（ESCRT）在内的囊泡运输相关蛋白参与AcMNPV感染Sf9细胞过程中的病毒进入和子代病毒颗粒释放。然而，宿主SM蛋白在AcMNPV感染周期中的具体功能和机制仍不清楚。为研究宿主细胞SM蛋白对AcMNPV感染是否至关重要，我们使用RNA干扰技术沉默了*SfRop*基因。系统评估了*SfRop*对AcMNPV基因组复制、基因表达、病毒核衣壳细胞内定位以及子代病毒释放的影响。同时，构建过表达重组病毒AcMNPV-*SfRop*-egfp以进一步验证*SfRop*在病毒复制周期中的功能。此外，初步探讨了潜在与*Rop*相互作用的SNARE蛋白Syntaxin1A（*SfSyx1*）和*SfSNAP25*在病毒复制和释放中的作用，并通过*SfRop*过表达挽救实验验证了其调控通路。## 章节片段### 细胞系、病毒和昆虫草地贪夜蛾IPLB-Sf21-AE克隆分离株9（Sf9）昆虫细胞保存在我们的实验室中，在细胞培养箱中以27°C在SIM SF无血清昆虫SF9/SF21培养基（中国北京，中乔新舟生物科技有限公司）中培养。重组杆状病毒AcMNPV-*egfp*此前由我们实验室构建，通过Bac-to-Bac系统（Thermo Fisher Scientific）将*egfp*基因插入AcMNPV基因组p10启动子控制下。三重mCherry标记的重组……### *SfRop*的进化分析和表达谱图1A显示了基于30个样本构建的主要节肢动物Rop蛋白的系统发育树。结果表明，同一目中的Rop蛋白聚集成簇，其中鳞翅目和膜翅目彼此关系更为密切。采用RT-qPCR技术检测了草地贪夜蛾各发育阶段*SfRop*基因的相对表达水平。如图1B所示，*SfRop*……### 讨论如图1B-D所示，时空表达谱分析显示，草地贪夜蛾不同发育阶段*SfRop*的转录丰度呈现先下降后升高的动态模式。第四龄幼虫中检测到的表达量最低，而卵、雌蛹和成虫中观察到高表达水平。我们推测*SfRop*可能参与两个关键变态转变：卵到幼虫和幼虫到成虫。组织表达……### CRediT作者贡献声明**冯欣雨**：写作——初稿撰写、方法论、调查、形式化分析、数据管理、概念化。**王晨**：写作——审阅与编辑、方法论、概念化。**鲍丽婷**：写作——审阅与编辑、方法论。**张文舒**：方法论。**傅跃军**：写作——审阅与编辑、项目管理、方法论、调查、资金获取、概念化。### 伦理审批本文不包含任何作者进行的人类参与者或脊椎动物研究。### 资助本研究由**中国国家自然科学基金**（项目编号：32673358）和**中央引导地方科技发展基金项目**（项目编号：YDZJSX2022A001）资助。### 利益冲突声明作者声明不存在利益冲突。---冯欣雨 | 王晨 | 鲍丽婷 | 张文舒 | 傅跃军山西医科大学，化学生物学与分子工程教育部重点实验室，生物技术研究所，太原 030006，中国