虎斑素作用机制的表征揭示了其对昆虫GABA受体的变构抑制作用

《Pesticide Biochemistry and Physiology》：Mechanistic characterization of tigolaner reveals allosteric inhibition of insect GABA receptors

　　

摘要

替加氟雷尼（Tigolaner）是一种近期开发的长效体外寄生虫杀虫剂，对跳蚤和蜱虫具有强效活性，但其分子作用机制仍不明确。本研究通过结合受体药理学、利用果蝇定点突变体进行的杀虫剂生物测定以及分子对接，探讨了替加氟雷尼如何与昆虫γ-氨基丁酸（GABA）门控氯离子通道相互作用。与孔道相关的A301S替换显著降低了经典非竞争性拮抗剂α-内硫磷的抑制活性，但在膜电位测定中仅导致替加氟雷尼效价约两倍下降。与此一致的是，携带A301S或A301N替换的果蝇品系对替加氟雷尼几乎不表现出或仅表现出轻微抗性，表明替加氟雷尼主要通过经典中央离子孔位点发挥作用。相比之下，跨膜亚基界面的G335M替换显著降低了替加氟雷尼的体外效价，并使果蝇突变体表现出12.5倍的抗性增加。对已确立的跨膜别构调节剂布罗氟尼利和异环氯塞胺也观察到了类似的抗性谱。分子对接进一步预测替加氟雷尼占据的是跨膜亚基界面口袋而非离子孔，其中多个疏水残基可能参与配体识别。总之，我们的结果为替加氟雷尼主要通过跨膜亚基界面相关的别构机制抑制昆虫GABA受体提供了药理学和体内遗传学证据。这些发现为理解替加氟雷尼的作用提供了机制基础，并可能促进下一代体外寄生虫杀虫剂的开发和抗性管理。

引言

在节肢动物中，GABA受体是五聚体配体门控Cl^?通道，负责中枢神经系统内的快速抑制性突触传递（ffrench-Constant et al., 1993a, ffrench-Constant et al., 1993b; Nakao and Banba, 2021）。由于其在神经元信号传导中的关键作用，昆虫GABA受体长期以来一直是杀虫剂的重要分子靶标（Ozoe, 2013）。环戊二烯类、苯基吡唑类等经典化合物作为RDL（对狄氏剂具有抗性）GABA受体的非竞争性拮抗剂（NCAs），通过干扰氯离子导通发挥作用，最终导致神经元过度兴奋和昆虫死亡（Asahi et al., 2015; Casida and Durkin, 2015; Nakao, 2015）。然而，NCAs的广泛使用促进了抗性的普遍进化，最常见的与RDL GABA受体亚基第二个跨膜结构域（TM2）中的A2′S或A2′N替换相关（Nakao, 2017; Qiao et al., 2024）。此外，包括异噁唑啉类和邻二酰胺类在内的新型化学类型通过跨膜结构域内的不同别构位点抑制昆虫GABA受体，从而对携带A2′突变的害虫保留了大量活性，进一步说明了该受体家族的药理学多样性（Blythe et al., 2022; Nakao et al., 2013; Nakao and Banba, 2016; Ozoe et al., 2010）。尽管如此，G335M替换显著降低了邻二酰胺类和异噁唑啉类的体外效价，并损害了其体内杀虫效果，尽管果蝇生物测定表明纯合突变难以在代际间维持（Blythe et al., 2022; Kono et al., 2022; Nakao et al., 2013; Ozoe et al., 2024; Yamato et al., 2020; Zhang et al., 2023; Zhou et al., 2024）。

替加氟雷尼（Tigolaner）是一种近期开发的体外寄生虫杀虫剂，对医学和兽医学重要的节肢动物具有强效广谱活性。它对跳蚤、蜱虫和其他体外寄生虫表现出高效，并被开发用于伴侣动物的长效寄生虫控制（Cveji? et al., 2022; Mencke et al., 2023）。已知替加氟雷尼作用于GABA受体，因为其先导化合物是通过高通量筛选鉴定的，该筛选方法测量了表达同源果蝇GABA受体的重组HEK-293细胞中GABA介导的氯离子通量（Décor et al., 2025）；然而，其精确的结合位点和体内遗传学证据仍不清楚。

在本研究中，我们主要利用果蝇作为体内模型来阐明替加氟雷尼的分子机制。通过比较其对野生型RDL受体和分别携带离子孔（A301S）或跨膜亚基界面（TSI）（G335M）突变的受体的活性，我们证明替加氟雷尼作为昆虫GABA受体的别构调节剂发挥作用。这些发现拓宽了我们对GABA受体靶向体外寄生虫杀虫剂分子药理学的理解，并为开发能够克服已确立靶标抗性的化合物提供了机制基础。

章节摘要

化学品

布罗氟尼利（纯度95%）、异环氯塞胺（纯度95%）和替加氟雷尼（纯度95%）由张立新博士（沈阳化工大学，沈阳，中国）惠赠。脱甲基布罗氟尼利（10,000 ppm，溶于DMSO）由南京农业大学吴顺帆教授赠送。α-内硫磷（纯度98%）购自阿拉丁（上海，中国），GABA（纯度99%）购自Sigma-Aldrich（德国）。

果蝇饲养与品系

果蝇品系在标准玉米粉-琼脂-糖蜜培养基上维持

结果

我们首先检查了1 μM替加氟雷尼对GABA诱导的受体激活的影响。替加氟雷尼显著降低了GABA的最大反应，但未产生浓度-反应曲线明显的平行右移，提示为非竞争性抑制模式（图1A和B）。为评估替加氟雷尼是否与经典孔道阻断型非竞争性拮抗剂（NCAs）作用于同一分子位点，我们首先检查了与孔道相关的A301S替换对其

讨论

GABA门控氯离子通道是体外寄生虫杀虫剂的确立靶标，因为破坏抑制性神经传递会迅速引发节肢动物的过度兴奋、麻痹和死亡。该靶标已支撑了多个化学类型不同的化合物类别的开发，包括苯基吡唑类、异噁唑啉类（Ozoe et al., 2010）和邻二酰胺类（Nakao et al., 2013）。替加氟雷尼是一种近期开发的双吡唑类体外寄生虫杀虫剂，具有强效的杀虫和杀螨

CRediT作者贡献声明

Qin Jianhui：撰写——初稿，方法论，形式分析，数据管理。Zhou Tianhao：撰写——初稿，方法论，形式分析，数据管理。Cheng Zihan：方法论，数据管理。Huang Jia：撰写——审阅与编辑，监督，项目管理，经费获取，概念化。

利益冲突声明

作者声明不存在利益冲突。

致谢

本研究得到了国家重点研发计划（2024YFE0100300）和国家自然科学基金（32472593和32272571）的资助。

Qin Jianhui|Zhou Tianhao|Cheng Zihan|Huang Jia

农业农村部作物病原微生物与昆虫分子生物学重点实验室，浙江大学昆虫科学研究所，杭州310058，中国