《Pesticide Biochemistry and Physiology》：Functional characterization of
CYP321A8 and
CYP6AB60 in diamide insecticides resistance in a field population of
Spodoptera litura
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摘要斜纹夜蛾（Spodoptera litura）是一种全球分布的农业害虫，对常用于防治该害虫的双酰胺类杀虫剂产生了日益增强的抗性。本研究通过生物测定和增效剂生物测定，测定了武汉（WH）田间种群与实验室敏感（SS）种群之间氯虫苯甲酰胺和氟苯虫酰胺的抗性倍数和增效倍数。结果表明
摘要
斜纹夜蛾（Spodoptera litura）是一种全球分布的农业害虫，对常用于防治该害虫的双酰胺类杀虫剂产生了日益增强的抗性。本研究通过生物测定和增效剂生物测定，测定了武汉（WH）田间种群与实验室敏感（SS）种群之间氯虫苯甲酰胺和氟苯虫酰胺的抗性倍数和增效倍数。结果表明，细胞色素P450单加氧酶（P450s）在斜纹夜蛾对这两种杀虫剂的抗性中发挥重要作用。随后，通过转录组测序筛选可能参与解毒途径的P450s，并鉴定出六个候选基因（CYP321A10、CYP321A15、CYP321B1、CYP321A8、CYP6B38和CYP6AB60）以供进一步研究。实时定量PCR显示，六个P450基因在WH种群中的相对表达水平均显著高于SS种群，且六个基因在中肠中的表达均显著高于脂肪体和马氏管。此外，构建了外源过表达这六个P450的转基因果蝇品系。生物测定结果表明，与对照品系（UAS-P450s）相比，P450过表达品系（Act5C > UAS-P450s或Esg > UAS-P450s）对氯虫苯甲酰胺和氟苯虫酰胺表现出增强的耐受性。此外，体外代谢试验表明，CYP321A8和CYP6AB60均可直接将氯虫苯甲酰胺和氟苯虫酰胺代谢为相应的代谢产物。分子对接结果进一步显示，这两种P450与这两种双酰胺类杀虫剂具有良好的结合相互作用。总之，这些结果表明，六个P450的上调表达有助于增强斜纹夜蛾对双酰胺类杀虫剂的解毒能力，其中CYP321A8和CYP6AB60尤其能够直接代谢这些化合物。这些发现对于抗性监测和可持续害虫管理策略的开发具有重要的应用潜力。
引言
烟夜蛾（斜纹夜蛾，Spodoptera litura，鳞翅目：夜蛾科）是一种典型的多食性和迁飞性害虫，危害数百种经济作物，包括蔬菜、棉花、烟草和大豆（Ahmad等，2007）。该害虫在全球广泛分布，已成为一种需要优先管理的重大农业害虫。目前，化学防治仍然是管理该害虫最直接和有效的策略；然而，长期频繁施用杀虫剂产生了持续的选择压力，导致不同地区的田间种群迅速进化出不同程度的抗性（Jin等，2024；Wang等，2025）。双酰胺类杀虫剂靶向昆虫的里安odies受体（RyR）。凭借其高效性、对哺乳动物低毒性、对鳞翅目害虫强特异性和对天敌影响低等特点，双酰胺类杀虫剂迅速成为防治斜纹夜蛾等鳞翅目害虫的主要工具（Du和Fu，2023）。然而，经过多年大量连续使用后，许多地区的鳞翅目害虫种群对双酰胺类杀虫剂产生了抗性，对田间害虫管理构成了严峻挑战。例如，从浙江和江西省采集的所有二化螟（Chilo suppressalis）田间种群对氯虫苯甲酰胺均表现出高水平抗性（RR = 158.7–536.8），湖南省的部分种群（RR = 230.6–314.5）对该杀虫剂也表现出相当高的抗性（Huang等，2020）。相对于实验室敏感株，中国18个地区的甜菜夜蛾（Spodoptera exigua）种群对氯虫苯甲酰胺的抗性倍数为103–1422倍（Fang等，2026）。中国江西的一个斜纹夜蛾田间种群对苯虫酰胺表现出157.4倍抗性，对氯虫苯甲酰胺表现出32.7倍抗性（Lu等，2026b）。2023年，澳大利亚西澳西北部一个斜纹夜蛾田间种群对氯虫苯甲酰胺的抗性超过实验室参照株的1000倍（Bird和Dunn，2025）。
昆虫对双酰胺类杀虫剂的抗性通常分为两类：靶标不敏感和代谢抗性（Huang等，2020；Lu等，2026b；Troczka等，2012）。靶标不敏感是由RyR上的点突变引起的，如二化螟中的Y4667D和斜纹夜蛾中的I4728M，已作为高水平抗性的主要驱动因素被广泛表征（Huang等，2020；Mei等，2023）。对双酰胺类杀虫剂的代谢抗性主要由三大解毒酶系统介导：细胞色素P450单加氧酶（P450s）、谷胱甘肽S-转移酶（GSTs）和羧酸酯酶（CarEs）（Guo等，2014；Lu等，2026b）。这些酶通过氧化、水解和结合等途径加速杀虫剂在体内的降解，从而降低杀虫剂毒性（Bass等，2014；Jin等，2024；Koirala等，2022；Li等，2023b；Li等，2024）。P450s构成昆虫中最大的解毒酶超家族，是适应有毒环境和杀虫剂抗性进化的核心功能基因家族（Bass等，2014；Chen等，2020；Liu等，2015；Nauen等，2022）。P450s表现出广泛的底物特异性和多样的催化活性，这种多样性由其结构多样性所支撑（Feyereisen，1999）。昆虫基因组中可能含有约100个P450基因，它们有时以簇的形式排列，每个P450编码一种不同的蛋白质，可分类为线粒体或微粒体型（Feyereisen，1999）。这些基因受复杂调控机制的调控，在植物化学适应中发挥核心作用，而影响其调控的突变在杀虫剂抗性的发展中起着关键作用（Bergé等，1998；Feyereisen，2006；Liu等，2015）。大量研究表明，P450表达水平的变化可以调节昆虫对杀虫剂的抗性。例如，斜纹夜蛾中SlCYP9A75a表达的上调或下调可以显著改变昆虫对氟苯虫酰胺、尼古丁和α-氰氟虫腈的耐受性（Li等，2024）。棉蚜CYP4CK1、CYP6CY5、CYP6CY9、CYP6CY19、CYP6CZ1和CYP6DA1在果蝇中外源过表达足以赋予对氟苯虫酰胺的抗性，其中CYP6DA1是主要贡献者（赋予12.24倍的抗性增加）（Ding等，2023）。除了体内基因表达调控研究和异源功能互补试验外，体外重组P450代谢系统可以直接阐明P450s对杀虫剂的催化解毒能力（Lu等，2026a）。体外代谢研究表明，草地贪夜蛾（Spodoptera frugiperda）的CYP321A9蛋白可以直接代谢氯虫苯甲酰胺和四氯虫苯甲酰胺，代谢产物分析证实了相应代谢途径的存在（Cao等，2026）。利用杆状病毒表达系统在Sf9细胞中表达甜菜夜蛾的CYP9A40蛋白，体外代谢试验表明CYP9A40可以显著代谢氯虫苯甲酰胺（Han等，2024）。总之，体内遗传功能分析和体外酶代谢试验均表明，P450系统是双酰胺类杀虫剂代谢抗性的基本分子基础。
本研究通过生物测定和增效剂生物测定，调查了P450s在斜纹夜蛾对氯虫苯甲酰胺和氟苯虫酰胺抗性中的参与作用。通过比较转录组测序鉴定了WH和SS种群之间的差异表达基因，并基于表达热图分析选取了六个候选P450。利用RT-qPCR检测了两个种群之间这六个基因的表达差异和组织分布模式。随后，转基因果蝇实验证实这六个P450能够赋予对氯虫苯甲酰胺和氟苯虫酰胺的抗性。此外，体外代谢试验和分子对接分析表明，CYP321A8和CYP6AB60可以直接代谢氟苯虫酰胺和氯虫苯甲酰胺，且具有有利的分子亲和力。总之，本研究从体内和体外多个方面提供了P450s在斜纹夜蛾双酰胺类杀虫剂解毒中发挥关键作用的多重证据。
节选片段
昆虫饲养
本研究使用的斜纹夜蛾相对敏感种群（SS）于2019年7月从吉林省农业科学院植物保护研究所获得。武汉田间种群（WH）于2025年从中国武汉的农田中采集。幼虫用人工饲料饲养，成虫用20%蔗糖溶液维持。所有饲养均在25 ± 2°C、65 ± 5%相对湿度（RH）和16小时
斜纹夜蛾对氯虫苯甲酰胺和氟苯虫酰胺的抗性及其系统效应PBO
对斜纹夜蛾三龄幼虫的生物测定结果表明，与SS种群相比，WH种群对氯虫苯甲酰胺和氟苯虫酰胺的抗性分别高出75.22倍和61.46倍，表现为致死浓度的升高（表1）。WH和SS种群的95%置信限（95% CL）不重叠，表明两个种群之间的LC50值差异具有统计学显著性（表1）。In
讨论
双酰胺类杀虫剂对斜纹夜蛾具有高效性；然而，由于长期不当施用，该害虫对这些化合物产生了不同程度的抗性（Ahmad等，2007；Tong等，2013；Zhang等，2022）。因此，阐明P450酶在此抗性过程中的具体作用是理解抗性进化机制和指导田间合理使用杀虫剂的关键。
在本研究中，生物测定
CRediT作者贡献声明
张子昕： 撰写——初稿、可视化、验证、调查、数据整理。金龙： 撰写——初稿、可视化、验证、方法学、数据整理。毛福荣： 资源。张小兵： 资源。赵海正： 资源。李桐霖： 资源。潘一鸥： 撰写——审阅与编辑、监督、调查、概念化。商庆礼： 撰写——审阅与编辑、监督、资金获取、概念化。
资助
本研究由吉林省科技发展计划——自然科学基金资助（20250102257JC）。
致谢
作者衷心感谢中国农业大学蔬菜花卉研究所杨新教授和路涵堂博士在细胞色素P450体外表达方面提供的宝贵帮助和指导。
张子昕|金龙|毛福荣|张小兵|赵海正|李桐霖|潘一鸥|商庆礼
吉林大学植物科学技术学院，长春 130062，中华人民共和国
