IDO1整合肠道菌群来源的SCFAs信号与宿主WNT/TGF-β通路介导甘草黄酮抗结直肠癌作用

《Pharmacological Research》：IDO1 integrates gut microbiota-derived SCFAs signals and host WNT/TGF-β pathways to mediate the anti-colorectal cancer effects of licorice flavonoids

　　

甘草黄酮（licorice flavonoids, LF）是甘草（Glycyrrhiza uralensis Fisch）中的生物活性成分，具有潜在的抗结直肠癌（colorectal cancer, CRC）活性，但其抑制CRC的机制尚不明确。本研究旨在阐明吲哚胺2,3-双加氧酶1（indoleamine 2,3-dioxygenase 1, IDO1）如何作为微生物来源信号与宿主致癌通路的下游汇聚效应分子，介导LF对CRC的化学预防作用。研究人员利用氧化偶氮甲烷（azoxymethane, AOM）/葡聚糖硫酸钠（dextran sulfate sodium, DSS）和Apc^min/+ CRC小鼠模型及结肠上皮细胞，结合16S rRNA测序、代谢组学、转录组学以及IDO1基因敲除、粪菌移植（fecal microbiota transplantation, FMT）和抗生素处理等功能学实验。结果表明，LF显著抑制结直肠肿瘤发生并恢复肠道屏障完整性。机制上，LF重塑肠道菌群，富集产短链脂肪酸（short-chain fatty acids, SCFAs）的菌属，包括Parabacteroides、Paramuribaculum和Parasutterella，从而增加粪便中丁酸、异丁酸、戊酸和异戊酸等SCFAs的水平。这些SCFAs下调CRC细胞中的IDO1，而IDO1基因消融可基本消除SCFAs诱导的抗增殖效应，确立了IDO1作为关键下游介导分子。该调控重塑了色氨酸代谢，减少犬尿氨酸代谢物并升高微生物相关的吲哚类代谢物。值得注意的是，在IDO1基因敲除小鼠中，LF对CRC的保护作用显著减弱，进一步证实IDO1是关键介导因子。此外，LF处理与WNT/TGF-β信号通路抑制相关。综上，这些结果将IDO1鉴定为响应LF对肠道菌群-SCFAs信号与宿主WNT/TGF-β通路调控的关键下游效应分子，提示LF诱导的IDO1抑制可能通过对微生物和宿主通路的同步调控，成为一种有前景的CRC预防转化策略。

**论文解读：IDO1作为甘草黄酮抗结直肠癌作用的关键汇聚效应分子——整合肠道菌群SCFAs信号与宿主WNT/TGF-β通路**

**一、研究背景与科学问题**

结直肠癌（colorectal cancer, CRC）是全球范围内癌症相关死亡的主要原因之一，近年来发病率持续上升。其发病机制涉及遗传变异、环境因素、生活方式以及肠道菌群失调的复杂相互作用。尽管外科手术、化疗和免疫治疗不断进步，但临床结局仍受限于系统毒性、耐药和高复发率。因此，开发有效且安全的化学预防药物已成为迫切需求。天然产物和传统中药因其多靶点特性和低毒性而日益受到关注。甘草（Glycyrrhiza uralensis Fisch）是一种广泛使用的药用植物，具有抗炎和抗肿瘤活性。甘草黄酮（licorice flavonoids, LF）作为甘草的主要生物活性成分，此前已被研究人员证明可抑制CRC细胞增殖并诱导细胞凋亡。然而，LF化学预防作用的整体机制仍不清楚，尤其是宿主内在信号与肠道生态系统之间的相互作用。肠道菌群失调在CRC发生中起关键作用，靶向菌群-肠道屏障轴已成为有效策略。色氨酸代谢作为连接肠道菌群、免疫应答和肿瘤进展的中枢环节，其分解代谢主要通过两条竞争性通路：由吲哚胺2,3-双加氧酶1（indoleamine 2,3-dioxygenase 1, IDO1）控制的宿主主导犬尿氨酸通路，以及微生物依赖的吲哚通路。在肿瘤微环境中，IDO1经常上调，催化色氨酸转化为免疫抑制性犬尿氨酸代谢物，促进免疫逃逸和肿瘤生长；而微生物吲哚代谢物可激活芳烃受体（aryl hydrocarbon receptor, AhR），增强肠道屏障功能并发挥抗炎作用。因此，通过抑制IDO1-犬尿氨酸轴的同时促进微生物吲哚通路来重编程色氨酸代谢，是CRC预防的一个有前景的策略。本研究旨在阐明LF如何通过整合微生物来源信号和宿主致癌通路来介导其对CRC的化学预防作用，特别是IDO1在这一过程中的关键角色。

**二、研究技术与方法**

研究人员采用多种CRC小鼠模型（C57BL/6J背景的AOM/DSS诱导炎症相关CRC模型和Apc^min/+自发CRC模型），并结合抗生素制备假无菌小鼠模型和粪菌移植（FMT）实验，以区分微生物依赖和非依赖机制；利用CRISPR/Cas9技术构建全身性IDO1敲除（IDO1^-/-）和肠上皮特异性IDO1敲除（IDO1^flox/flox villin-cre）小鼠；通过16S rRNA基因测序、靶向色氨酸代谢物LC-MS/MS分析、粪便SCFAs GC-MS定量、RNA-seq转录组学、免疫组化、透射电镜以及CRC细胞系（HCT-116和DLD-1，来源于中国科学院上海细胞库）功能学实验，系统阐明LF的作用机制。

**三、主要研究结果**

**3.1 LF在炎症驱动和自发CRC模型中发挥化学预防作用**
在AOM/DSS和Apc^min/+两种模型中，LF剂量依赖性显著减少结肠肿瘤数量和大小，恢复DSS诱导的结肠缩短，减轻组织学损伤和恶性转化，并抑制Ki67阳性细胞增殖，高剂量LF（416 mg/kg）效果与阳性对照瑞戈非尼相当。

**3.2 LF恢复CRC小鼠肠道上皮屏障完整性**
免疫组化显示LF恢复结肠上皮E-钙黏蛋白（E-cadherin）和紧密连接蛋白ZO-1的膜定位，转录水平上调CDH1和Ocln基因表达，PAS染色显示杯状细胞数量增加，透射电镜证实LF恢复紧密连接的超微结构，Western blot验证E-cadherin、ZO-1和Occludin蛋白水平升高。

**3.3 LF重塑肠道菌群并通过FMT传递抗CRC保护**
16S rRNA测序显示LF显著增加α多样性，β多样性分析显示LF组与对照组明显分离；LF富集产SCFAs的有益菌属Parabacteroides、Paramuribaculum和Parasutterella，减少促炎菌属。将LF处理小鼠粪便移植给抗生素预处理受体小鼠后，受体鼠肿瘤数量显著减少、结肠长度增加，证明LF重塑的菌群本身足以传递部分肿瘤保护作用。

**3.4 LF重编程宿主和微生物色氨酸代谢**
血清氨基酸代谢组学鉴定出色氨酸代谢为最显著改变通路。靶向代谢组学显示LF抑制犬尿氨酸通路代谢物，促进吲哚通路代谢物，降低犬尿氨酸/色氨酸比值（IDO1酶活指标）。Western blot和ELISA证实LF下调结肠组织IDO1蛋白表达，而IDO2和TDO2不变。相关分析显示LF富集菌属与犬尿氨酸代谢物负相关、与吲哚代谢物正相关。

**3.5 LF在假无菌小鼠中发挥微生物非依赖性抗肿瘤和屏障保护作用**
在抗生素清除菌群的假无菌CRC模型中，LF仍减少肿瘤数量和负担、减轻组织学损伤、抑制增殖、上调紧密连接蛋白，表明LF具有不依赖菌群的直接抗肿瘤和屏障保护作用，但缓解结肠缩短的效应依赖菌群。

**3.6 LF独立于肠道菌群特异性抑制IDO1-犬尿氨酸轴**
在假无菌小鼠中，LF仍显著抑制犬尿氨酸通路代谢物并降低Kyn/Trp比值，下调IDO1蛋白，而吲哚通路代谢物几乎检测不到且不受LF影响；IDO2和TDO2表达不变，证实LF特异性抑制IDO1-犬尿氨酸轴，吲哚通路主要依赖菌群。

**3.7 菌群来源的SCFAs介导LF对IDO1-犬尿氨酸轴的抑制**
粪便SCFAs谱分析显示LF显著升高丁酸、异丁酸、戊酸和异戊酸水平。Spearman相关分析显示SCFAs与犬尿氨酸代谢物负相关、与吲哚衍生物正相关，且LF富集的菌属与SCFAs正相关。体外实验证明四种SCFAs以时间和浓度依赖性方式抑制HCT-116细胞增殖并下调IDO1蛋白。在IDO1敲低（shRNA）和敲除（KO）细胞中，SCFAs的抗增殖效应在KO细胞中基本消失（最高浓度40 mmol/L时细胞活力仍高于50%），双因素方差分析显示IDO1基因型与SCFAs处理间存在显著交互作用，证明SCFAs的抗增殖效应通过IDO1介导。

**3.8 LF介导的WNT和TGF-β信号抑制与IDO1下调相关**
RNA-seq显示LF处理下调WNT和TGF-β通路基因，GSEA确认两条通路显著抑制，RT-qPCR验证TGFB1、SMAD7、DKK1和CTNNB1下调。WNT激动剂HLY78和TGF-β激动剂SRI-011381可上调IDO1，而LF可消除这种上调；WNT/β-catenin抑制剂XAV939和TGF-β受体I抑制剂SB-431542亦降低IDO1蛋白。在IDO1-KO细胞中，LF无法抑制迁移、集落形成和增殖，表明IDO1是LF发挥直接抗肿瘤作用的汇聚靶点。但需注意，WNT/TGF-β抑制与IDO1下调之间的关系仍属相关性发现。

**3.9 IDO1是LF抗CRC疗效所必需**
在全身性IDO1^-/-小鼠中，LF减少肿瘤数量和负担的效应基本消失，不能降低血清犬尿氨酸，也不能上调C-MYC和CYP1A1（AhR下游靶基因），组织学保护作用丧失。而在肠上皮特异性IDO1敲除（IDO1^flox/flox villin-cre）小鼠中，LF仍保留部分治疗效果，提示肠上皮IDO1是关键靶点，但LF完全抗肿瘤作用还需肠上皮以外的额外机制。

**四、讨论与结论**

本研究证明LF通过靶向关键代谢免疫检查点IDO1在两种CRC模型中发挥强效抗肿瘤作用。机制上，LF重塑肠道菌群、富集产SCFAs有益菌，SCFAs进而抑制IDO1并重编程色氨酸代谢；同时LF直接抑制宿主WNT和TGF-β信号通路从而下调IDO1。全身性和肠上皮特异性IDO1敲除显著减弱LF疗效，确立IDO1为连接微生物依赖和非依赖药理作用的关键汇聚节点。研究还发现LF介导的IDO1抑制可影响AhR及其下游靶基因功能，提示IDO1抑制不仅阻断单一酶促步骤，而是重新平衡整个色氨酸代谢网络，形成有利于上皮完整性和抗肿瘤效应的微环境。研究结论指出，IDO1是LF抗肿瘤活性的关键下游效应分子，通过微生物依赖和非依赖双重机制实现；LF诱导的IDO1抑制通过对微生物和宿主通路的同步调控，为CRC预防提供了机制框架和有前景的转化策略。研究局限性包括：SCFAs调控IDO1的具体分子机制（受体或表观遗传修饰）尚需深入探究；LF在人体中的药代动力学和口服生物利用度有待充分表征；IDO1直接酶活测定和免疫学功能验证未在本次研究中开展。