《International Journal of Cancer》：Gene Expression Biomarkers for Breast Ductal Carcinoma in Situ Recurrence Prediction
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乳腺导管原位癌（DCIS）常因缺乏稳健的预后及预测工具而被过度治疗。本研究旨在评估一个特征明确的DCIS队列中的基因表达情况，以确定其作为同侧复发生物标志物的临床效用。研究人员从原发性DCIS的显微切割组织中提取RNA，并利用NanoString技术对174例
乳腺导管原位癌（DCIS）常因缺乏稳健的预后及预测工具而被过度治疗。本研究旨在评估一个特征明确的DCIS队列中的基因表达情况，以确定其作为同侧复发生物标志物的临床效用。研究人员从原发性DCIS的显微切割组织中提取RNA，并利用NanoString技术对174例DCIS病例（其中131例无复发，43例有复发）进行了129个基因panel的分析。通过Cox回归分析确定与复发的关联，并采用免疫组织化学（IHC）方法进行验证。研究人员从NanoString数据中推导出一个新的7基因panel（PBK, COL1A2, GSTM5, MMP2, MX1, SLC22A3 和 ZEB1），但该panel无法在外部数据集中得到验证，包括按放疗（RT）治疗分层后亦是如此。在发现队列和验证队列中，ZEB1 单独表达增加始终与更长的无复发生存期显著相关（风险比（HR）0.56–0.71）。mRNA与蛋白表达之间的相关性显示，与导管周围成纤维细胞表达的关联最强。然而，在独立队列中，这些细胞中ZEB1蛋白的表达与复发并无关联。现有的多基因panel在当前队列中显示出与复发不一致的关联。基因表达panel在不同队列间的可重复性有限，这凸显了进行前瞻性试验和情境特异性验证的必要性。ZEB1 mRNA作为一种潜在生物标志物浮现出来，值得进一步研究其在指导DCIS管理决策中的临床效用。
论文解读
一、研究背景与问题
乳腺导管原位癌（DCIS）是乳腺X线筛查中常见的发现，通常通过保乳手术联合或不联合辅助放疗（RT）进行治疗。虽然RT可将同侧复发率降低约一半，但现有疗法可能对相当一部分女性造成过度治疗。部分DCIS可能进展极为缓慢甚至永不进展为有临床意义的浸润性疾病，目前有多项临床试验正在测试对低风险DCIS采取“观察等待”策略。然而，如何定义“低风险”存在争议，且缺乏稳健的生物标志物或决策辅助工具来预测复发。目前美国国家综合癌症网络（NCCN）指南中唯一推荐的生物标志物是雌激素受体（ER），用于确定他莫昔芬的使用。尽管已有多种用于浸润性乳腺癌的基因表达检测方法，如Prosigna（PAM50）、MammaPrint和Oncotype DX，但它们在DCIS中的适用性和预测价值尚不明确。因此，亟需开发能够准确预测DCIS复发的生物标志物，以避免过度治疗并优化个体化管理决策。
二、研究目的与设计
本研究旨在利用NanoString平台，结合现有基因表达panel和来自乳腺癌相关通路（包括放射敏感性、上皮-间质转化（EMT）、免疫相关基因和染色体不稳定（CIN））的额外基因，评估基因表达作为DCIS同侧复发预测生物标志物的临床效用。研究人员在发现队列（n=174，来自Peter MacCallum癌症中心、皇家墨尔本医院、诺丁汉城市医院及LifePool前瞻性队列）中进行分析，并在两个独立外部RNAseq数据集（Strand et al.队列n=231和Martinez-Perez未发表队列n=161）中进行验证。同时，通过免疫组织化学（IHC）在多个独立队列中验证ZEB1蛋白表达。
三、主要关键技术方法
研究人员利用NanoString平台对从显微切割的FFPE组织中提取的RNA进行129个基因的表达分析。采用Cox比例风险回归模型进行单变量和多变量分析，以评估基因表达与复发的关联。为开发新分类器，研究人员使用带弹性网络惩罚的多变量Cox模型，并通过5折交叉验证进行参数调优。外部验证在两个独立RNAseq数据集上进行。此外，通过免疫组织化学（IHC）在组织微阵列（TMA）和全切片上评估ZEB1蛋白表达，以验证mRNA水平的发现并确定表达ZEB1的细胞类型。
四、研究结果
1. 发现队列评估：在174例成功进行NanoString分析的病例中（131例无复发，43例有复发），多变量分析显示仅RT治疗与复发风险降低显著相关。ER阳性、HER2阳性、年龄较小和非高级别与复发风险降低相关，但均未达到统计学显著性。
2. 现有基因表达panel的评估：在发现队列中，细胞周期进展（CCP）panel和PAM50风险复发评分（ROR-PC）在单变量分析中与局部复发显著相关，而Oncotype DX DCIS和CIN panel则无显著关联。CCP评分在多变量分析中仍显著。在外部数据集1中，所有四个评分作为连续变量均显著，但仅PAM50 ROR-PC作为分类变量显著；在数据集2中，所有评分在单变量分析中显著，但多变量分析中均不显著。按RT分层后，各panel的关联性不一致，无法在外部数据集中得到稳健验证。
3. 新panel的开发：研究人员通过弹性网络Cox模型开发了一个新的7基因panel（PBK, COL1A2, GSTM5, MMP2, MX1, SLC22A3 和 ZEB1），内部测试显示其性能优异（连续评分HR=4.54，分类HR=4.60）。然而，该panel在外部数据集中的验证未能显示强关联，无论是否接受RT。
4. ZEB1作为目标基因：ZEB1 是模型中最强的单个预测因子。在发现队列和两个外部数据集中，ZEB1 表达增加与复发风险降低显著相关（HR 0.56–0.71），尤其在未接受RT的病例中效应更为明显。IHC分析显示，mRNA与蛋白表达的相关性在导管周围成纤维细胞中最强（r=0.87），但ZEB1蛋白表达与复发无显著关联。高基质ZEB1与HER2阳性相关，且与导管周围免疫细胞密度相关。
五、讨论与结论
本研究发现多基因panel（包括现有和新开发的）在考虑临床病理变量后，均未能稳健地预测DCIS复发。这种缺乏稳健性凸显了在治疗方式各异的中心之间使用回顾性队列进行DCIS生物标志物研究的挑战。ZEB1 表达增加与复发风险降低的关联是一个有趣的发现，因为EMT基因通常与乳腺癌等癌症的不良预后相关。研究人员推测，ZEB1可能通过导管周围成纤维细胞和免疫微环境介导其保护作用，或通过细胞质表达限制侵袭潜能。研究存在若干局限性，包括临床病理数据不完整、内分泌治疗信息缺失、样本量相对较小以及缺乏集中化的ER/HER2检测。结论认为，多基因panel在DCIS复发预测中的可重复性有限，真实世界中的预后生物标志物效用可能只能通过前瞻性研究确定。尽管如此，ZEB1 是一个值得未来研究的基因，既可作为生物标志物，也可作为限制DCIS细胞侵袭的机制靶点。该研究支持基质在DCIS临床行为中发挥关键作用，但可能只是向浸润性疾病进展中众多复杂且相互作用因素之一。
