《Biotechnology and Applied Biochemistry》：Stabilization by Crosslinking of β-Galactosidase Immobilized by Adsorption for Application in a Continuous Lactose Removal Process
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吸附是酶固定化最简单的方法，但通常需要额外处理以提高稳定性，而这些处理可能影响酶活性。本研究考察了交联对通过吸附固定于A-568树脂上的β-半乳糖苷酶稳定性的影响及其对酶活性的影响。采用不同浓度戊二醛（0.50%–0.80% v/v）对固定化酶进行交联处理，并
吸附是酶固定化最简单的方法，但通常需要额外处理以提高稳定性，而这些处理可能影响酶活性。本研究考察了交联对通过吸附固定于A-568树脂上的β-半乳糖苷酶稳定性的影响及其对酶活性的影响。采用不同浓度戊二醛（0.50%–0.80% v/v）对固定化酶进行交联处理，并评估了热稳定性（30°C–60°C）、连续重复使用稳定性以及不同pH值（3–8）下储存90天的稳定性。本研究还评估了固定化酶在工业过程中的可行性，这一方面通常未被涉及。在连续反应器中，于不同进料流速（4–10 mL/min）下评估了乳糖转化能力。结果表明，戊二醛（0.50%）交联为吸附于树脂上的酶提供了更高的稳定性，在连续使用循环结束时仍保留其初始活性的90%以上。交联改善了酶的热稳定性，其半衰期在所有温度下均提高了一倍以上。储存条件对未交联酶的影响更大，该酶表现出对极端pH的不耐受，在pH 3、7和8下丧失超过60%的初始活性，而交联酶在所有pH值下储存90天后仍保留70%以上的初始活性。两种酶在连续工艺中均显示出巨大的工业应用潜力。尽管交联酶表现出较高的操作稳定性，但其乳糖转化率较低。
论文解读
一、研究背景与问题
β-半乳糖苷酶（EC 3.2.1.23）是一种在食品和制药工业中具有重要商业价值的酶，广泛应用于生产无乳糖牛奶、酸奶等乳制品，并可通过转糖基作用合成益生元低聚糖。然而，游离酶无法回收复用，且稳定性低，在极端温度、pH或有机溶剂条件下易发生变性。为解决酶的结构脆弱性并提高其工业可用性，固定化技术被广泛采用。其中，离子交换树脂吸附固定化方法简单、经济，树脂具有良好的化学和机械稳定性、可重复使用、高孔隙率和大活性表面积。但吸附固定化的酶与载体之间的作用力（氢键、范德华力、静电作用）较弱，存在酶脱附风险，影响稳定性和回收率。交联（crosslinking）通过化学修饰在载体与生物催化剂结构单元之间形成共价键，可增强吸附固定化酶的稳定性。戊二醛（glutaraldehyde）是常用的高效交联剂，可建立酶与载体之间的多点共价连接。然而，多数关于交联提高酶稳定性的研究未评估其在工业应用中的可行性，尤其是考虑反应时间和产物形成的连续操作性能。为此，研究人员开展了本研究，旨在考察交联对吸附固定于Duolite A-568树脂上的β-半乳糖苷酶稳定性的影响，以及其对乳糖转化能力的影响。
二、研究内容与结论概述
研究人员将来自地衣芽孢杆菌（Bacillus licheniformis）的β-半乳糖苷酶通过离子吸附固定于Duolite A-568阴离子交换树脂上，并用不同浓度戊二醛（0.50%–0.80% v/v）进行交联处理。研究评价了交联对酶重复使用稳定性、热稳定性、储存稳定性及连续流反应器中乳糖转化稳定性的影响。结果表明，0.50%戊二醛交联显著提高酶的重复使用稳定性（连续使用5次保持90%以上初始活性）、热稳定性（半衰期在所有温度下提高一倍以上）和储存稳定性（pH 3–8下90天保持70%以上初始活性）。虽然交联导致初始乳糖转化率下降，但交联酶在连续操作6小时后仍保持80%以上的初始转化能力，而未交联酶在操作中损失约50%。两种酶均显示出工业应用于连续乳糖去除工艺的潜力，但适用场景不同：未交联酶适用于快速完全水解，交联酶更适用于长期、极端条件或部分乳糖去除的工艺。
三、主要关键技术方法
研究人员使用来源于Bacillus licheniformis的β-半乳糖苷酶（Novozymes，丹麦），载体为Dow Chemical Company提供的Duolite A-568弱碱性阴离子交换树脂。固定化前，树脂经盐酸和氢氧化钠活化处理。固定化条件依据前期研究确定：0.5 g活化树脂加入10 mL酶溶液（BR缓冲液，pH 4.0），室温下150 rpm搅拌2小时，最终酶载量为1800 U/g载体。交联处理采用不同浓度戊二醛（0.50%–0.80% v/v）。酶活测定采用乳糖水解初始速率法，通过葡萄糖氧化酶法在505 nm波长定量葡萄糖。热稳定性实验在30、40、50、60°C下进行，数据拟合Arrhenius模型计算热失活常数和半衰期。操作稳定性在连续微型生物催化反应器中运行6小时，改变进料流速（4–10 mL/min）评估乳糖转化率。储存稳定性在pH 3–8的BR缓冲液中4°C储存90天测定残留活性。
四、研究结果
3.1 固定化产率、效率和活性回收
固定化产率、效率和活性回收是评价固定化过程、载体生物相容性和方法有效性的基本参数。在室温下，以1800 U
酶/g
载体的酶载量将β-半乳糖苷酶固定于Duolite A568树脂，获得的固定化产率为86%，效率为99%，活性回收为83%。高固定化产率归因于工艺效率、酶与载体间良好的生物相容性以及方法适宜性。与已有文献中纳米颗粒固定化效率46%相比，本研究采用的离子交换树脂表现出更优的固定化效率。
3.2 戊二醛浓度对酶重复使用稳定性的影响
为确定最佳戊二醛浓度，研究人员用0.50%–0.80%戊二醛处理固定化酶，并连续复用6次。结果显示，0.50%戊二醛交联的酶在第五次使用前保持90%以上初始活性，稳定性最佳。浓度高于0.60%时，酶活性和稳定性下降，原因是过度交联使酶刚性增加，活性位点可及性降低或发生变形。交联通过形成分子间和分子内共价键以及聚集体来保护酶活性位点，并防止酶从载体脱附。
3.3 热稳定性
在30–60°C范围内，交联酶的热稳定性均高于未交联酶。50°C时，未交联酶15分钟即损失50%活性，而交联酶需45分钟。60°C下两种酶失活均加剧，但未交联酶更严重。Arrhenius模型拟合得到未交联酶半衰期（30、40、50、60°C）分别为1395.27、347.97、15.91和1.29分钟，交联酶分别为8110.15、1204.87、42.93和2.20分钟，交联使半衰期在所有温度下提高一倍以上。热失活活化能从未交联酶的249.86 kcal/mol增至交联酶的276.42 kcal/mol，表明交联形成的共价键和化学修饰使酶热变性需要更多能量。
3.4 乳糖转化稳定性
在连续反应器中运行6小时，改变进料流速（4–10 mL/min）评估乳糖转化能力。未交联酶受流速影响显著，在6 mL/min时产物形成最高；高流速降低底物停留时间，低流速可能导致产物抑制。未交联酶在6小时操作后丧失约50%初始转化能力。交联酶初始转化率较低，但操作稳定性更高，在低于10 mL/min流速下6小时末仍保留80%以上初始转化能力。戊二醛交联虽降低表观催化活性（因非特异性反应改变酶构象、增加扩散限制），但显著增强操作稳定性。从工业角度看，稳定性提高可抵消初始活性损失带来的成本。
3.5 储存稳定性
在pH 3–8、4°C储存90天，未交联酶在pH 7和8下1天即失去约一半活性，pH 3、7、8下损失超过60%初始活性，pH 4–6下残留活性较高。交联酶在所有pH值下90天保持70%以上活性。交联提供的化学和多点连接修饰拓宽了固定化酶的适宜储存pH范围，并减少了脱附风险，使酶在不利条件下仍受载体保护。
五、总结与结论
研究人员通过吸附固定化并结合戊二醛交联，显著改善了β-半乳糖苷酶的储存稳定性和热稳定性，并提高了其在连续操作中的转化稳定性。固定化过程本身具有简单、低成本、高效率的优点。0.50%戊二醛浓度为最佳交联条件，更高浓度会降低酶柔韧性。交联酶表现出更长的半衰期和更宽的pH适应性，而未交联酶在快速水解方面更有效。从工业应用看，未交联固定化酶适用于快速完全乳糖水解；交联酶更适合长期运行、部分乳糖去除或极端温度与pH条件下的操作。研究还提出了未来方向，包括结构分析、动力学表征、其他交联剂探索及更长时间稳定性评估，以进一步优化稳定性与活性之间的平衡。总之，吸附-交联策略为工业连续乳糖去除工艺提供了一种可行的生物催化剂设计方案。
