《ChemBioChem》：De Novo Discovery of Bioactive Cyclic Peptides via Cellular Selection of Genetically Encoded Libraries
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细胞筛选已成为高通量从头发现生物活性环肽的一种强大策略。该方法将遗传编码的环肽文库与目标蛋白共表达于细胞内，利用可定制的筛选系统将期望的环肽活性与可选择的表型相关联，从而直接鉴定功能性抑制剂。细胞筛选已针对多种治疗靶点成功获得众多环肽抑制剂，并且随着环肽多样性
细胞筛选已成为高通量从头发现生物活性环肽的一种强大策略。该方法将遗传编码的环肽文库与目标蛋白共表达于细胞内，利用可定制的筛选系统将期望的环肽活性与可选择的表型相关联，从而直接鉴定功能性抑制剂。细胞筛选已针对多种治疗靶点成功获得众多环肽抑制剂，并且随着环肽多样性和筛选手段的扩展而不断增强。本综述总结了利用遗传编码环肽文库进行细胞筛选的相关研究，并探讨了该技术未来应用的前景。
1 引言
环肽因其模块化和可遗传编码的特性，成为药物发现中一类多功能的分子骨架。展示类平台如噬菌体展示和mRNA展示促进了从大型遗传编码文库中从头鉴定环肽先导化合物，但这些方法通常依赖基于结合的筛选，可能富集缺乏功能活性的高亲和力结合物，且局限于可纯化固定的靶标。相比之下，细胞筛选通过将环肽功能与宿主细胞内的可选择表型偶联，可直接鉴定具有生物活性的环肽，同时免去蛋白纯化步骤，扩大了可靶向的范围。
2 分裂内含肽介导的肽和蛋白质环化连接
SICLOPPS是利用内含肽剪接实现环肽生物合成的最广泛策略，可用于在大肠杆菌、酵母和哺乳动物细胞中构建多样性环肽文库。
2.1 利用SICLOPPS生物合成环肽
SICLOPPS方法利用分裂内含肽将目标肽序列的头尾连接起来实现环化。多数研究采用集胞藻属PCC6803的DnaE分裂内含肽，其第一个环肽残基需固定为半胱氨酸或丝氨酸作为亲核试剂。研究表明不同序列的环化效率差异显著，部分序列存在不完全剪接。采用来自点状念珠藻的DnaE内含肽可改善剪接效率和序列宽容度，但可能带来毒性。
2.2 利用SICLOPPS环肽文库进行细胞筛选
2.2.1 利用反向双杂交系统筛选蛋白-蛋白相互作用破坏剂
反向双杂交系统被广泛用于鉴定蛋白-蛋白相互作用抑制剂。该系统通过将目标蛋白融合至噬菌体阻遏物的DNA结合域，使基因抑制依赖于蛋白-蛋白相互作用。当环肽破坏该相互作用时，报告基因表达产生可选择的表型。该策略已成功用于鉴定核糖核苷酸还原酶复合物、HIV Gag p6与TSG101的UEV结构域相互作用、HIF-1α与HIF-1β相互作用等靶标的环肽抑制剂。这些抑制剂的解离常数通常在微摩尔级别，通过引入非经典氨基酸可提升约10倍的效力。近期研究还引入了下一代测序技术以提高筛选通量和降低假阳性率。
2.2.2 利用酵母双杂交系统筛选靶蛋白结合物
酵母双杂交系统用于筛选环肽与靶蛋白的结合，但由于头尾环化的环肽缺乏游离末端，无法直接融合转录激活域。研究者通过在SICLOPPS前体中引入突变使其停留在套索中间体状态，从而保留C端内含肽片段用于融合转录激活域。该策略已用于鉴定LexA调控蛋白和组蛋白去乙酰化酶8的结合物，后者通过引入非经典氨基酸模拟底物，获得了纳摩尔级亲和力的强效抑制剂。
2.2.3 筛选蛋白聚集抑制剂
聚集倾向性蛋白是蛋白错误折叠疾病的分子驱动因素，但其聚集特性使得体外筛选困难。利用酵母α-突触核蛋白病模型的表型筛选可从SICLOPPS文库中鉴定出缓解α-突触核蛋白毒性的环肽。更通用的策略是构建目标蛋白与荧光蛋白或RNA聚合酶的融合报告系统，通过荧光激活细胞分选或噬菌体辅助连续选择来筛选聚集抑制剂。这些方法已成功用于鉴定Aβ42、超氧化物歧化酶和人胰岛淀粉样多肽的环肽抑制剂，并可通过负筛选提高选择性。
2.2.4 筛选蛋白酶抑制剂
通过在报告蛋白中嵌入蛋白酶识别位点，可将蛋白酶抑制转化为细胞存活或荧光信号增强等可检测表型。利用该策略，研究者从SICLOPPS文库中鉴定了细菌ClpXP蛋白酶的非常规非竞争性抑制剂。另一项研究通过将非经典氨基酸对苯甲酰苯丙氨酸引入文库，筛选到HIV蛋白酶的新型别构抑制剂，该抑制剂通过形成席夫碱加合物作用于活性位点外的赖氨酸残基。
2.2.5 筛选具有新作用机制的抗菌药物
利用定制化筛选系统，可针对传统抗生素不涉及的靶点进行机制导向的抗菌药物发现。研究者设计了针对细菌RNA伴侣Hfq和替代sigma因子σE的筛选系统，分别鉴定了相应的环肽抑制剂。这些抑制剂在体外显示活性，但外源添加时因膜通透性问题未能表现出抗菌活性，凸显了将初步命中化合物转化为有效先导化合物的挑战。
3 侧链间交联环肽
除头尾环化外，还可通过侧链间交联产生遗传编码的环肽文库。例如，大环有机-肽杂合体利用亲核氨基酸与电亲和非经典氨基酸之间的反应产生环肽。另一种方法是利用双烷基化亲电试剂交联近端半胱氨酸残基，产生订书肽形式的α螺旋肽。结合转录阻断存活筛选系统，该方法已用于鉴定致癌转录因子CREB1的强效抑制剂。
4 核糖体合成和翻译后修饰肽
核糖体合成和翻译后修饰肽是一类多样的天然产物，其遗传编码性和生物合成模块性使其适用于构建组合文库。
4.1 羊毛硫肽
羊毛硫肽含有硫醚交联结构。ProcM酶因其出色的序列耐受性和在大肠杆菌中的易表达性而被用于构建文库。利用反向双杂交系统，研究者从ProcM催化的羊毛硫肽文库中鉴定了p6:UEV相互作用的抑制剂，其效力优于此前从SICLOPPS文库获得的同类抑制剂。
4.2 自由基非α硫醚肽
自由基非α硫醚肽含有半胱氨酸与受体残基β或γ碳之间的硫醚交联，由自由基S-腺苷甲硫氨酸成熟酶催化。研究者开发了基于PapB的ranthipeptide文库，并结合分裂σ因子重建系统筛选SARS-CoV-2刺突蛋白的结合物，最终鉴定出一个单交联的环肽结合物。
5 总结与展望
尽管细胞筛选已获得许多生物活性环肽，但仍存在局限性：更多靶点类别需要兼容的筛选系统；环肽命中物的效力往往不足，可通过扩大文库规模和化学多样性改善；细胞筛选易产生假阳性，需结合二次筛选或负筛选；环肽的膜通透性未在筛选中评估，后续需进行药物化学改造。未来致力于开发更稳健的筛选系统和更多样化的环肽文库，将有助于充分发挥该方法的潜力。
