《ChemBioChem》：NMR-Guided Fragment Screening Identifies Privileged Noncanonical Amino Acids for mRNA Display
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片段化策略已改变了小分子药物发现领域，然而在肽类药物发现中，利用类似方法筛选非经典氨基酸（noncanonical amino acids, ncAAs）的策略仍鲜有探索。研究人员引入了一种NMR引导的筛选工作流程，将单个ncAA视为“片段”，在建库之前识别优
片段化策略已改变了小分子药物发现领域，然而在肽类药物发现中，利用类似方法筛选非经典氨基酸（noncanonical amino acids, ncAAs）的策略仍鲜有探索。研究人员引入了一种NMR引导的筛选工作流程，将单个ncAA视为“片段”，在建库之前识别优势单体。以p53–MDM2相互作用为基准体系，研究人员筛选了一系列色氨酸类似物，并鉴定出6-溴色氨酸和6-氯色氨酸（6Br-Trp和6Cl-Trp）为相较于天然Trp具有更高亲和力的片段。将6Br-Trp引入模型肽可提高其对MDM2的结合能力，表明氨基酸水平的亲和力可直接转化为肽水平的结合增益。研究人员进一步证明，6Br-Trp和6Cl-Trp可被高效装载至tRNA，并利用PURE翻译系统掺入肽中。在mRNA展示筛选中，含有6Br-Trp和6Cl-Trp的肽相比含有Trp的对应肽表现出更强的富集。这些结果表明，ncAA片段筛选可作为前端策略，用于指导mRNA展示高通量肽发现中的单体选择。ncAA筛选还为将肽库引导至更有效的化学空间提供了途径，从而加速针对高难度蛋白靶点的高亲和力配体鉴定。
**论文解读：NMR引导的片段筛选用于mRNA展示中优势非经典氨基酸的鉴定**
**1. 研究背景与问题**
蛋白-蛋白相互作用（protein-protein interactions, PPIs）界面通常平坦且缺乏特征，传统小分子药物难以有效靶向，而肽类药物因能适应大而浅的界面而备受关注。mRNA展示等技术可构建包含海量序列的肽库，并从20种经典氨基酸出发快速发现中等至高等亲和力的肽配体。然而，初始筛选得到的肽往往需要大量优化才能成为临床候选药物，常用的优化手段之一是将非经典氨基酸（noncanonical amino acids, ncAAs）替换到肽序列中。这一过程通常需要逐一测试数百至数千个替换，耗时费力。如果能在建库前提前知晓哪些ncAA对特定靶点最优，就可以直接使用这些优势单体构建肽库，从而大幅缩短开发流程。小分子药物领域的片段筛选（fragment-based drug discovery, FBDD）通过NMR等生物物理方法预先筛选低分子量构建块，再将其组装成高亲和力配体。受此启发，研究人员提出将单个ncAA视为肽抑制剂的“片段”，在建库前利用NMR筛选出能结合靶蛋白特定口袋的优势ncAA，再将其嵌入mRNA展示肽库，实现“预映射”蛋白界面并提升肽筛选效率。
**2. 研究目标与总体设计**
本研究以著名的癌症靶点MDM2（murine double minute 2）为模型体系。MDM2与肿瘤抑制因子p53以α-螺旋界面结合，导致p53功能失活。p53的Phe19、Trp23和Leu26三个残基占据MDM2结合界面的大部分，其中Trp23是能量贡献最大的热点。基于已知的构效关系（structure-activity relationship, SAR）数据，研究人员选择MDM2的色氨酸结合口袋作为切入点，筛选一组色氨酸类似物，验证片段水平的结合亲和力是否能预测肽水平的表现，并进一步将筛选出的ncAA整合到mRNA展示流程中检验其优势。
**3. 主要技术与方法**
研究人员首先利用蛋白观测的NMR（protein-observed NMR）技术对氨基酸及其类似物进行滴定。他们表达了同位素标记的MDM2蛋白（质粒来源：Addgene #62063，由Gary Daughdrill惠赠），通过记录1H–15N HSQC谱的化学位移扰动（chemical shift perturbations, CSPs）评估结合。为测定亲和力，将滴定数据拟合为包含配体消耗的方程，得到全局表观解离常数（Kd）。随后，研究人员通过固相肽合成制备含Trp或6Br-Trp的荧光标记肽，并用荧光偏振（fluorescence polarization）测量其与MDM2及对照蛋白牛血清白蛋白（BSA）的结合。为验证6Br-Trp的可翻译性，研究人员采用体外转录制备E. coli tRNATrp，用色氨酰-tRNA合成酶（TrpRS）催化6Br-Trp的装载，并通过MALDI-MS验证产物，再在PURE（protein synthesis using recombinant elements）无细胞翻译系统中掺入6Br-Trp-tRNATrp进行翻译。最后，在mRNA展示筛选中，研究人员构建了包含已知MDM2结合肽序列（Seq-1含ncAA，Seq-2含Trp，通过沉默突变区分）和同长度随机肽库的mRNA池，经紫外交联、体外翻译、反转录、Ni-NTA纯化后，对MDM2包被的链霉亲和素磁珠进行一轮筛选，通过下一代测序（NGS）和AptaSuite软件分析富集情况。
**4. 研究结果**
**4.1 氨基酸水平NMR筛选表明6Br-Trp和6Cl-Trp为优势片段**
研究人员首先在NMR滴定中测试了丙氨酸、亮氨酸、苯丙氨酸和色氨酸。丙氨酸和亮氨酸无明显CSP，苯丙氨酸和色氨酸产生明显CSP，其中色氨酸表观Kd为29.5 ± 5.2 mM，表明Trp23是p53–MDM2界面的主要能量热点。随后筛选的色氨酸类似物中，7-aza-Trp、3-苯并噻吩基-L-丙氨酸（S-Trp）和6-甲氧基色氨酸（6-MeO-Trp）未检测到结合，而6Cl-Trp和6Br-Trp表现出结合。CSP模式与天然Trp高度重叠，表明它们结合在同一口袋。经滴定拟合，6Cl-Trp的Kd为7.7 ± 0.6 mM，6Br-Trp的Kd为3.1 ± 0.3 mM，均显著优于天然Trp，其中6Br-Trp亲和力最高。
**4.2 肽水平验证：含6Br-Trp的肽亲和力提高约3倍**
研究人员合成了一段已知的MDM2结合肽（Pep1）及其含6Br-Trp的变体（Pep1-BrTrp），通过荧光偏振测定结合常数。结果显示，Pep1-BrTrp与MDM2的亲和力约为Pep1的3倍，而两者对BSA均无结合。该结果直接证明，氨基酸片段水平的亲和力优势可传导至完整肽中。
**4.3 体外翻译验证：6Br-Trp可有效装载并掺入肽**
研究人员用E. coli TrpRS对6Br-Trp-tRNA进行酶促装载，MALDI-MS确认装载成功（需要较高酶和底物浓度，提示其为弱底物）。将预装载的6Br-Trp-tRNA加入PURE系统，翻译含UGG密码子的mRNA，可得到含6Br-Trp的肽，产量略低于天然Trp但水平相当。这证明6Br-Trp可被翻译机器接受。
**4.4 mRNA展示筛选：含ncAA的肽富集显著高于天然Trp**
研究人员在mRNA展示实验中将编码已知MDM2结合肽的Seq-1（含6Br-Trp或6Cl-Trp）和Seq-2（含Trp）与随机肽库混合，经一轮针对MDM2的筛选后，NGS分析显示Seq-1的富集显著高于Seq-2。6Br-Trp组和6Cl-Trp组的富集差异均具有统计学显著性（p < 0.05和p < 0.0001）。这表明，在mRNA展示环境下，含优势ncAA的肽比含天然Trp的肽更有效地被选择。
**5. 讨论与结论**
研究人员将结果与已知MDM2 SAR数据对照，6-ClTrp在既往研究中已表现出提高结合的特性，晶体结构显示6-氯基团更有效地填充Trp口袋，且口袋有空间容纳更大的6-取代基。本研究的NMR亲和力排序6Br-Trp > 6Cl-Trp > Trp与此结构观察一致。研究人员指出，CSP映射的表面覆盖了MDM2大部分结合口袋，单一氨基酸结合可能产生长程效应或多位点结合，但最终仍能转化为mRNA展示的富集优势。
研究提出，并非所有结合口袋都适合此筛选方法。MDM2界面中仅Trp表现出可被NMR检测的亲和力，Leucine未产生CSP表明无特征界面或弱结合可能难以检测。对于更平滑的靶点，可借助反胶束NMR、固定化靶标NMR、氢氘交换质谱或高浓度晶体浸泡等方法提高灵敏度。此外，氨基酸带电荷的α-氨基和α-羧基可能在疏水口袋中造成静电排斥，未来使用衍生化的不带电荷类似物或能扩展到更低亲和力位点。
氨基酸水平的亲和力与肽水平表现之间的关系并非严格线性，肽支架可能产生超加性或协同效应。因此，片段筛选应视为优先级排序工具而非严格预测模型。对于更大规模筛选，仅检测到结合事件即可标记候选物，不需精确测定Kd。
方法学上，使用天然E. coli TrpRS的底物混杂性可装载6Cl-Trp和6Br-Trp，但更通用的方案是Flexizyme RNA催化剂，其可为多种ncAA装载tRNA，从而扩展单体范围。与Derda的遗传编码片段发现（GE-FBD）相比，本研究直接将氨基酸本身作为片段，可在单个肽库中包含多种ncAA，mRNA展示已有包含多达12种ncAA的报道。该策略不仅适用于无已知肽配体的新靶点，还能提供结合位点的结构信息，帮助构建“位点感知”的肽库。
此外，片段引导的ncAA筛选可简化肽药物化学流程，在肽合成前缩小搜索空间，单体可重复用于不同靶点，并支持多位点组合优化。对于合成复杂度高的环肽，该策略尤其有益。未来可研究片段组合的协同效应，以及将片段结合数据用于计算模型参数化，以预测肽水平能量。总体而言，本研究确立了ncAA片段筛选作为mRNA展示高通量肽发现的前端策略，能加速针对临床相关蛋白靶点的高亲和力、结构优化肽治疗药物的开发。研究结论部分从原文翻译为：**综合来看，这些结果确立了ncAA片段筛选作为引导高通量肽发现的前端策略。该方法与现有mRNA展示工作流程无缝整合，即使对于先前SAR数据有限的靶点也能提供可操作的见解。因此，片段引导的肽库设计有望加速在一系列临床相关蛋白靶点上发现更高亲和力、结构更优化的肽治疗药物。**
