化脓性链球菌核酸酶A干扰补体膜攻击复合物组装的分子机制

《Communications Biology》：Molecular mechanism of complement interference by Streptococcus pyogenes nuclease A

　　

细菌通过部署毒力因子来破坏宿主免疫，然而这些相互作用的分子细节往往仍然有限。本研究揭示了化脓性链球菌核酸酶A（SpnA）的结构和宿主互作组。研究人员利用氢-氘交换质谱（HDX-MS）和单颗粒冷冻电子显微镜（cryoEM）表征了SpnA的结构与动态特性，首次获得了SpnA的结构学见解。这使研究人员能够识别出一个额外的寡核苷酸结合（OB）结构域，其柔性结构可能在核酸水解活性中发挥重要功能。亲和 pull-down 质谱（AP-MS）鉴定出补体系统膜攻击复合物（MAC）C5b67组分是关键的相互作用因子。交联质谱（XL-MS）结合整合建模确定了SpnA与C5b67之间的结合界面。这些界面在遗传多样化的化脓性链球菌菌株中高度保守。SpnA与C5b67之间的相互作用被认为可阻止功能性MAC的组装。本研究结果揭示了SpnA在补体抑制中的新功能，并确定了预防和治疗化脓性链球菌感染的新潜在靶点。

化脓性链球菌（Streptococcus pyogenes，GAS）是一种人类特异性革兰氏阳性病原菌，可引起从轻度皮肤感染到坏死性软组织感染、菌血症、链球菌中毒性休克综合征乃至急性风湿热和肾小球肾炎等多种疾病，全球每年导致超过60万例侵袭性感染和约16万例死亡。补体系统是先天免疫的核心组成部分，通过经典、凝集素和替代三条途径汇聚于共同效应功能，包括调理吞噬、炎症触发和膜攻击复合物（MAC）组装以裂解靶膜。MAC通过C5b、C6、C7、C8和聚合C9的顺序组装形成跨膜孔道。虽然革兰氏阳性菌因具有肽聚糖细胞壁而被认为对MAC介导的裂解具有抗性，但新近证据表明这种抗性并非绝对。化脓性链球菌已进化出多种补体逃逸策略，如M蛋白结合因子H和C4b结合蛋白（C4BP）抑制补体活化，链球菌补体抑制剂（SIC）和补体逃逸因子（CEF）干扰MAC形成。化脓性链球菌核酸酶A（SpnA）是该菌唯一确定的细胞壁锚定DNA酶，以往研究主要集中于其通过降解中性粒细胞胞外陷阱（NETs）逃避免疫的功能，但其是否直接靶向补体系统尚不清楚。

研究人员首先通过氢-氘交换质谱（HDX-MS）和单颗粒冷冻电子显微镜（cryoEM）解析了SpnA的apo状态结构，获得2.60 ?分辨率的单体结构模型，发现SpnA实际含有四个寡核苷酸结合（OB）结构域（OB1-OB4），而非此前认为的三个，其中新发现的OB4结构域位于OB3和核酸内切/外切酶结构域（NUCL）之间，具有高度柔性。通过亲和pull-down质谱（AP-MS）在正常人类血浆中鉴定出35个高置信度SpnA相互作用蛋白，其中补体MAC组分C5、C6、C7、C8α、C8β、C8γ和C9显著富集。利用分别缺失C3、C5、C6、C7、C8或C9的人血清进行AP-MS实验，证实SpnA特异性靶向MAC组装中间体C5b67。交联质谱（XL-MS）结合HADDOCK整合建模确定了SpnA的OB2结构域β3折叠片、OB2-OB3环、NUCL结构域及无序N端区域与C5b6和C7的直接相互作用界面。对20,580个全球分离株基因组分析显示，这些相互作用界面在433种SpnA蛋白等位基因中高度保守。溶血抑制实验表明SpnA以浓度依赖方式显著抑制补体介导的红细胞裂解，且通过结合C5b67中间体阻止C8和C9的招募，从而在液相中阻断功能性MAC的组装。

该研究首次提供了SpnA的实验测定结构，揭示了第四个OB结构域的存在，阐明了SpnA通过直接结合C5b67组装中间体、空间阻碍C8和C9招募进而抑制MAC形成的全新补体逃逸机制。这一发现扩展了对化脓性链球菌免疫逃逸策略的认识，SpnA的相互作用界面在不同菌株间的保守性提示其可作为预防和治疗化脓性链球菌感染的潜在药物靶点。