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骨骼修饰在人类进化中发挥了核心作用，促成了两足行走、大颅穹隆和分娩等适应性特征。尽管这些变化十分重要，但赋予人类独特形态的遗传改变在很大程度上仍属未知。研究人员系统绘制了塑造人类骨骼进化的基因调控变化图谱。利用软骨细胞中的大规模平行报告分析（MPRA），检测了
骨骼修饰在人类进化中发挥了核心作用，促成了两足行走、大颅穹隆和分娩等适应性特征。尽管这些变化十分重要，但赋予人类独特形态的遗传改变在很大程度上仍属未知。研究人员系统绘制了塑造人类骨骼进化的基因调控变化图谱。利用软骨细胞中的大规模平行报告分析（MPRA），检测了启动子和增强子中的561,410个人类来源替换，鉴定出15,077个人类特异性调控活性位点。随后，研究人员生成人类-猿杂交细胞并将其分化为骨软骨祖细胞。将杂交细胞与MPRA测量进行整合，产生了人类特异性顺式调控表达变化的全基因组图谱以及驱动这些变化的序列变异。这些图谱揭示了细胞外基质（ECM）的广泛重塑，包括糖胺聚糖（GAG）生物合成的显著抑制，这导致人类与非人猿类相比关节GAG含量降低约3至4倍。研究人员发现，这种人类特异性转变带有选择的特征，并且很可能是人类对退行性骨骼疾病异常易感性的关键促成因素。总之，研究结果揭示了人类骨骼ECM的协调进化重塑，并为剖析人类骨骼生物学的遗传基础建立了综合框架。
**研究背景与科学问题**
人类在骨骼系统上表现出区别于其他大型猿类的独特表型，如两足运动、纤细骨骼和大颅穹隆。尽管这些骨骼特征在表型层面已被充分描述，但驱动其形成的遗传改变以及随之而来的病理机制仍缺乏系统认识。种间表型分化被认为主要由基因调控变化驱动，其中顺式调控元件（cis-regulatory elements, CREs）通过控制靶基因的时空表达在骨骼进化中具有核心地位。大规模平行报告分析（massively parallel reporter assay, MPRA）此前已用于人类与尼安德特人、丹尼索瓦人的分化研究，但多数工作聚焦于神经细胞类型或狭窄位点类别（如人类加速区域），覆盖范围有限。特别是对于在人类谱系中固定或近乎固定、可能由正选择驱动的衍生替换，其功能效应尚未被系统研究。为此，研究人员以软骨细胞为模型，系统绘制了人类骨骼进化的基因调控图谱。
**研究策略与核心技术**
研究人员基于139个非人猿个体（10倭黑猩猩、59黑猩猩、43大猩猩、27猩猩）的基因组数据，结合gnomAD v.2.1.1、三个高覆盖度尼安德特人基因组和一个高覆盖度丹尼索瓦人基因组进行严格过滤，构建了包含561,410个人类固定替换的候选调控变异目录。在人类胎儿软骨细胞中进行慢病毒MPRA（lentiMPRA），测定了366,402个序列对（732,804个序列）的调控活性。同时，将人-大猩猩和人-黑猩猩诱导多能干细胞（iPS细胞）融合生成杂交细胞，并分化为肢骨骨软骨祖细胞，利用等位基因特异性表达鉴定顺式调控表达差异。此外，研究人员对139个关节软骨样本（来自42个人类个体和7个非人猿个体）进行二甲基亚甲基蓝（DMMB）定量分析，测定硫酸化糖胺聚糖（sGAG）含量。整合以上多平台数据，构建了基因-调控元件的功能图谱。
**调节人类基因活性的变异。**通过lentiMPRA对561,410个人类衍生替换的系统测定，结合MPRAnalyze量化分析，研究人员鉴定出65,576个（17.90%）具有显著活性的序列对，其中15,077个（23.0%）活性CREs表现出人类与大猿等位基因间的显著差异活性（FDR≤0.05）。质量控制指标（DNA复杂度、RNA复杂度、重现性、动态范围及与内源信号一致性）均显示实验具有高稳健性，证实这些差异活性反映了真实的调控改变。
**杂交细胞揭示调控进化。**研究人员利用人-黑猩猩和人-大猩猩杂交骨软骨祖细胞，以猩猩为外群进行谱系极化分析，鉴定出4,152个黑猩猩特异和4,463个人类特异的顺式调控表达变化。通过将MPRA差异活性cCRE与其靶基因关联，建立了人类骨骼调控进化的多层级图谱。
**GAG代谢是进化热点。**通过IPA、GO、HPO和GAD四种数据库的功能富集分析，GAG代谢通路在MPRA差异活性cCRE相关的基因中富集最为显著（GO中GAG代谢过程2.2倍富集，FDR=0.03；IPA显示GAG代谢为最显著下调过程）。在杂交细胞中，21个GAG相关基因中17个呈人类特异性下调，且下调幅度平均约为上调基因的两倍。谱系特异性选择检验显示，软骨素硫酸生物合成、肝素硫酸生物合成和GAG降解三个通路组分均显著偏向下调。此外，编码多能蛋白聚糖（aggrecan）的ACAN基因表现出人类特异性扩增，平均增加6个重复（即12个GAG锚定位点），并存在两个不同的人类单倍群，提示该基因在人类谱系中经历了加速进化。
**GAG减少塑造了人类关节进化。**对139个关节软骨样本的DMMB定量分析显示，人类在所有8个关节中的sGAG含量均显著低于非人猿，总体平均减少约3倍（P=1.5×10
?5），单个关节的减少幅度为2.6至4倍。这种差异与年龄、性别及机械负荷无关。表型框架分析进一步表明，由GAG减少驱动的表型与人类特异表型显著富集（2.9倍富集，P=9.8×10
?3），提示GAG下调可能同时影响人类骨骼形态和疾病易感性。
**讨论与结论。**人类关节GAG含量减少约62%，大于退行性疾病患者中观察到的25–38%的降低幅度，提示进化性GAG缺失可能将人类软骨推向易损阈值。人类退行性骨骼疾病（尤其是骨关节炎）的患病率显著高于非人猿，且关节内直接给予GAG可缓解症状，支持GAG减少与疾病易感性之间的关联。选择信号分析显示，GAG通路下调部分特征符合负选择放松的预期，但下调程度超出中性预期、蛋白质编码区保守性正常以及较大的表型效应，提示可能存在非中性选择压力。ACAN锚定重复的扩张可能反映负选择放松或对GAG减少的补偿性适应。无论具体机制如何，人类GAG代谢的转变均指示塑造骨骼生物学的选择压力发生了改变。总之，研究结果揭示了人类骨骼细胞外基质（ECM）的协调进化重塑，并建立了一个用于解析人类骨骼生物学遗传基础的综合框架。
