肝细胞通过提供丝氨酸促进胰腺癌肝转移的机制研究

《Nature》：Hepatocytes promote liver metastasis of pancreatic cancer by providing serine

　　

肝脏是胰腺导管腺癌（pancreatic ductal adenocarcinoma, PDAC）转移的主要部位，肝转移是患者死亡的主要原因。转移微环境中的营养可利用性影响肿瘤定植效率，但播散肿瘤细胞的代谢异质性也可重塑局部微环境。磷酸甘油酸脱氢酶（phosphoglycerate dehydrogenase, PHGDH）是丝氨酸从头合成的限速酶，其在近40%的PDAC中缺失，导致这些细胞依赖外源性丝氨酸（exogenous serine, exSer）。尽管已有研究揭示神经元-肿瘤代谢交互作用在原位肿瘤中支持exSer依赖性PDAC细胞，但这类细胞在肝脏转移微环境中的适应机制尚不清楚。本研究显示，exSer依赖性PDAC细胞通过CXCL5-CXCR2轴重编程邻近肝细胞。肝细胞中CXCR2的激活促进PI3K-AKT信号传导，导致FOXO3A在细胞质中滞留并解除对PHGDH转录的抑制，从而增强肝细胞中的丝氨酸合成。这种肝细胞来源的丝氨酸支持exSer依赖性PDAC肝转移的生长。相应地，对CXCL5-CXCR2-PI3K-AKT-FOXO3A轴各节点的遗传或药理抑制，或肝细胞特异性敲除Phgdh或Cxcr2，均可显著减少小鼠肝转移负荷并延长生存期，尤其在膳食丝氨酸受限时效果更为显著。研究结果揭示了一种癌细胞-肝细胞代谢交互信号，并为exSer依赖性PDAC肝转移提供了治疗靶点。

研究背景与问题

胰腺导管腺癌（pancreatic ductal adenocarcinoma, PDAC）是一种高度恶性的消化系统肿瘤，肝转移是其主要致死原因。既往研究已证实，约37.2%的原发性PDAC肿瘤存在磷酸甘油酸脱氢酶（phosphoglycerate dehydrogenase, PHGDH）表达缺失，这类肿瘤细胞因缺乏新丝氨酸合成能力，必须依赖外源性丝氨酸（exogenous serine, exSer）维持生存与增殖。在原位肿瘤中，这类exSer依赖性PDAC细胞通过神经生长因子（nerve growth factor, NGF）驱动的肿瘤神经支配，获取感觉神经释放的丝氨酸，构成一种独特的代谢脆弱性。然而，在转移灶中，特别是肝转移微环境中，exSer依赖性PDAC细胞如何获取丝氨酸尚不明确。由于肝转移患者通常不适合手术切除，临床样本获取受限，这一科学问题长期未获解答。本研究旨在揭示exSer依赖性PDAC细胞在肝脏转移微环境中的丝氨酸获取机制，为靶向治疗提供新策略。

研究内容与结论：

研究人员通过分析快速尸检项目获取的人PDAC肝转移样本，发现31.3%的肝转移肿瘤细胞PHGDH表达阴性，与原发性肿瘤中缺失比例相当。值得注意的是，PHGDH阴性转移灶周围的肝细胞呈现强PHGDH表达，而PHGDH强阳性转移灶周围肝细胞则表达弱或阴性，呈现互为相反的表达模式。这一发现在小鼠模型中同样得到验证。研究人员通过CRISPR-Cas9技术敲除小鼠PDAC细胞系HY19636的Phgdh基因，证实PHGDH缺失的肿瘤细胞可诱导邻近肝细胞PHGDH表达上调。为验证肝细胞PHGDH的功能作用，研究人员利用AAV介导的体内CRISPR编辑技术构建了肝细胞特异性Phgdh敲除小鼠，在丝氨酸和甘氨酸缺乏（–SG）饮食条件下，肝细胞Phgdh缺失显著降低exSer依赖性PDAC细胞的肝转移负荷，而完全氨基酸饮食可部分挽救这一抑制作用，提示饮食丝氨酸可补偿肝细胞来源丝氨酸的缺失。

体外共培养实验证实，在–SG条件下，exSer依赖性PDAC细胞生长显著受损，但与原代小鼠肝细胞共培养后生长恢复。利用¹³C₆-葡萄糖示踪实验，研究者在与肝细胞共培养的sgPhgdh PDAC细胞中检测到M+3标记的丝氨酸，证实肝细胞新合成丝氨酸并释放至培养基后被PDAC细胞摄取。通过RNA测序分析，研究人员鉴定出CXCL5为候选信号分子，其在共培养条件下的sgPhgdh PDAC细胞中显著上调。CXCL5在人类肝转移样本中浓度升高，在PHGDH弱表达或阴性转移灶中水平最高。敲除PDAC细胞中的Cxcl5基因可消除肝细胞介导的生长挽救作用，而重组CXCL5可完全恢复该作用。肝细胞特异性Cxcr2敲除小鼠同样表现出对exSer依赖性PDAC肝转移的显著抑制。

进一步机制研究显示，CXCL5-CXCR2信号通过激活PI3K-AKT通路，促进FOXO3A磷酸化并滞留于细胞质中，解除其对Phgdh基因启动子的转录抑制作用。染色质免疫沉淀（ChIP）实验证实FOXO3A可直接结合Phgdh启动子中的TGTTT核心基序。非磷酸化FOXO3A（AAA）突变体的表达可模拟PI3K抑制效应，增强FOXO3A与Phgdh启动子的结合并抑制肝细胞丝氨酸产生。在治疗策略层面，CXCR2抑制剂SB225002联合–SG饮食可显著降低exSer依赖性PDAC肝转移负荷并延长生存期，且不影响原发肿瘤生长。在原位移植后切除原发肿瘤的自发转移模型中，CXCR2抑制无论于术后早期还是晚期给药，均能显著减少肝转移复发。

研究结论：

本研究揭示了一条CXCL5-CXCR2-PI3K-AKT-FOXO3A-PHGDH轴，通过该轴，PHGDH缺失、exSer依赖的PDAC细胞在肝转移微环境中重塑肝细胞氨基酸代谢，以支持转移性生长。该发现支持肿瘤内在代谢状态可诱导器官特异性基质程序，为根据肿瘤代谢特征和解剖部位定制治疗策略提供了基础。联合饮食丝氨酸限制与CXCR2抑制有望成为PHGDH缺失型PDAC肝转移患者围手术期或术后干预的有效策略。

关键技术与方法：

研究人员主要运用了以下关键技术：快速尸检项目获取的32例人PDAC肝转移样本及正常肝组织进行免疫组化和免疫荧光分析；CRISPR-Cas9基因编辑技术构建基因敲除细胞系及AAV介导的体内肝细胞特异性基因敲除小鼠模型；¹³C₆-葡萄糖稳定同位素示踪结合气相色谱-质谱联用（GC-MS）分析代谢流；RNA-seq转录组测序及通路富集分析；染色质免疫沉淀（ChIP）技术验证转录因子结合；共培养体系及条件培养基实验；小鼠肝转移模型（脾内注射及原位移植后切除原发灶模型）评估肿瘤负荷与生存期。

研究结果分述：

肝细胞PHGDH在PDAC邻近区域上调：通过人肝转移样本和裸鼠肝转移模型，发现PHGDH阴性转移灶周围肝细胞PHGDH表达显著增强，而PHGDH阳性转移灶周围肝细胞表达弱，提示肝细胞通过上调丝氨酸合成来代谢支持exSer依赖性PDAC细胞。

PDAC细胞PHGDH缺失诱导肝细胞PHGDH表达：利用CRISPR敲除HY19636细胞Phgdh基因后，小鼠肝转移模型中邻近肿瘤的肝细胞PHGDH表达显著上调，证实肿瘤细胞PHGDH缺失是驱动肝细胞PHGDH上调的原因。

肝细胞PHGDH支持转移：肝细胞特异性Phgdh敲除小鼠在–SG饮食下显著减少exSer依赖性PDAC肝转移负荷，而完全氨基酸饮食可部分挽救，证明肝细胞来源的丝氨酸对转移定植和生长至关重要。

肝细胞挽救exSer依赖性PDAC细胞：共培养实验表明，在–SG条件下肝细胞可恢复exSer依赖性PDAC细胞生长；¹³C₆-葡萄糖示踪证实肝细胞新合成的丝氨酸可被肿瘤细胞摄取利用。

PDAC来源条件培养基驱动肝细胞丝氨酸供应：sgPhgdh细胞条件培养基可促进肝细胞丝氨酸合成和分泌，表明肿瘤分泌的旁分泌因子在肝细胞代谢重编程中发挥作用。

CXCL5-CXCR2轴驱动丝氨酸交互信号：RNA-seq鉴定出CXCL5为关键候选因子，其表达在PHGDH缺失PDAC细胞中上调，且在人类肝转移样本中水平与肿瘤PHGDH状态相关。敲除Cxcl5可消除肝细胞介导的生长挽救作用，肝细胞特异性Cxcr2敲除小鼠同样抑制exSer依赖性PDAC肝转移。

CXCL5-CXCR2支持PHGDH缺失PDAC：体内实验证实，Phgdh/Cxcl5双敲除PDAC细胞肝转移负荷显著低于单敲除，且邻近肝细胞PHGDH表达下降，肿瘤细胞增殖减少。

CXCR2-AKT通过FOXO3A解除PHGDH抑制：通路分析显示PI3K-AKT信号通路显著富集；CXCR2或PI3K抑制可增强FOXO3A核定位及与PhGDH启动子结合；非磷酸化FOXO3A突变体表达可抑制肝细胞丝氨酸产生，证实FOXO3A为PHGDH的转录抑制因子。

CXCR2抑制联合–SG饮食抑制PHGDH缺失PDAC：SB225002与–SG饮食联用在肝转移模型中显著降低肿瘤负荷、延长生存，并在原位移植后切除原发灶的自发转移模型中减少肝转移复发，且不影响原发肿瘤生长。

讨论与结论：

研究人员指出，CXCL5-CXCR2轴并非所有PHGDH缺失病变的通用机制，而是肝转移微环境特异的代谢交互通路，在围手术期或术后复发预防中具有重要治疗价值。由于CXCR1/2抑制剂已进入PDAC临床研究阶段（如SX-682），且–SG饮食已在I期临床试验中证实安全性，该联合策略具有临床转化潜力。研究还指出，与系统性PHGDH抑制剂相比，CXCR2抑制的优势在于可阻断肿瘤诱导的肝细胞丝氨酸供应，同时保留正常组织中的补偿性新丝氨酸合成途径。研究存在一定局限性，包括人样本来自终末期快速尸检标本，可能受摄入减少和恶病质影响；CXCL5在PDAC细胞中诱导机制及肝细胞丝氨酸外排机制尚未阐明；肝细胞来源丝氨酸在人体内对肿瘤生长的支持程度仍需进一步研究。总体而言，该研究揭示了肿瘤内在代谢状态可诱导器官特异性基质程序，为根据肿瘤代谢状态和解剖部位制定个体化治疗策略提供了新思路。