双位点激酶抑制剂的设计策略

《Nature》：A design approach for bitopic kinase inhibitors

　　

传统的激酶抑制剂在效力和选择性之间面临权衡，因为其亲和力依赖于单个高度保守结合位点中有限的分子相互作用。双位点抑制剂通过结合同一靶标上的多个位点而克服这一局限¹。本文以ABL1和EGFR作为模型激酶，系统探索了双位点特异性设计参数——配体选择、连接向量和连接子长度，并表明它们通过配体间协同性（inter-ligand cooperativity）和连接子熵（linker entropy）影响效力。研究人员将该方法应用于解决一项未满足的临床需求：ABL1（BCR::ABL1驱动白血病中的重要靶点）的现有抑制剂受耐药突变和脱靶效应限制²。第三代抑制剂ponatinib克服了许多耐药突变，但心血管毒性限制了其临床应用³。研究人员设计了一种双位点ABL1抑制剂PonatiLink-2，其对耐药突变体维持或超越了ponatinib的效力。此外，该抑制剂在体外和体内均具有更宽的治疗窗口，从而可在无明显毒性的情况下增加给药剂量。在BCR::ABL1驱动的癌症小鼠模型中，PonatiLink-2联合dasatinib针对野生型BCR::ABL1、以及单药针对ponatinib耐药疾病的疗效均优于临床相关治疗方案。这些发现表明，双位点设计策略是开发效力强、耐受性好的ABL1及其他靶点临床抑制剂的一种有前景的方法。

**双位点激酶抑制剂的设计策略：从原理探索到PonatiLink-2的临床前验证**

**研究背景与问题**

激酶调控众多基础细胞过程，其失调是许多疾病的根源。小分子激酶抑制剂是最早的靶向癌症疗法之一，自2001年伊马替尼（imatinib）获批用于治疗BCR::ABL1融合基因驱动的慢性髓性白血病（CML）以来，已有大量抑制剂进入临床。然而，传统激酶抑制剂常面临耐药突变和脱靶效应的挑战，限制其临床效用。针对ABL1这一在BCR::ABL1驱动白血病中的重要靶点，现有抑制剂存在两大主要问题：第一，多数患者需终身治疗，仅约20%的CML患者能达到无治疗缓解；第二，ATP结合位点的耐药突变可使酪氨酸激酶抑制剂（TKI）失效。第三代TKI ponatinib虽能克服包括T315I在内的单核苷酸耐药突变，但具有FDA黑框警告的严重心血管事件风险，且对E255V/T315I等复合突变无效。变构抑制剂asciminib通过结合ABL1特异的肉豆蔻酰结合口袋提高选择性，但其对耐药突变效力中等，对T315I需五倍临床剂量，且对多种突变无效。联合ponatinib和asciminib虽有前景，但毒性仍是限制因素。因此，开发兼具ponatinib效力和asciminib选择性的ABL1抑制剂，有望通过更深的分子应答和更少的不良反应改善患者预后。

**研究目标与设计策略**

双位点（bitopic）抑制剂通过连接两个亲和配体，结合同一靶标上的两个不同位点，可利用亲合力（avidity）获得更高的效力和选择性。然而，双位点抑制剂的设计原理仍不清楚。研究人员以ABL1和EGFR为模型激酶，系统研究活性位点配体选择、连接向量和连接子长度如何通过配体间协同性和连接子熵影响效力，并将这些原理应用于开发PonatiLink-2——一种对严重耐药突变具有改善活性且降低脱靶毒性的双位点ABL1抑制剂。

**主要技术方法**

研究人员合成了基于dasatinib或ponatinib连接asciminib的系列双位点化合物，使用柔性聚乙二醇（PEG）连接子，构建三个系列以探索结构-活性关系。关键技术包括：基于NanoLuc的生物发光共振能量转移（NanoBRET）活细胞亲和力测定，用于评估配体结合协同性；原子级分子动力学（MD）模拟（每化合物三重复0.5 μs）分析连接子均方根波动（RMSF）与熵的关联；KINOMEscan和SelectScreen激酶组筛选评估选择性；饱和诱变文库结合深度测序鉴定耐药突变谱；以及异种移植小鼠模型评价体内疗效。样本队列来源包括K562细胞系（CML患者来源）、H1975和A549肺癌细胞系、健康人外周血单个核细胞，以及865个细胞系的PRISM筛选。

**研究结果**

**双位点ABL1抑制剂的设计与效力**：研究人员合成了DasatiLink、PonatiLink-1和PonatiLink-2三个系列，改变活性位点配体、连接向量和连接子长度。较长的连接子通常提高生化效力，但最长连接子的化合物细胞效力降低，提示生化亲和力与细胞通透性之间存在权衡。各系列先导化合物中，PonatiLink-2（连接子为17个PEG单元）对表达BCR::ABL1^T315I的K562细胞和纯化ABL1(T315I)效力最强，甚至超过ponatinib。KINOMEscan实验表明，100倍过量的asciminib将PonatiLink-2的表观亲和力降低20倍，而ponatinib不受影响，证实了亲合力对PonatiLink-2效力的重要贡献。

**ABL1配体结合协同性**：NanoBRET实验显示，dasatinib与asciminib之间存在负协同性（2.5倍K_d,apparent增加），而ponatinib的负协同性较弱（1.7倍）。反向验证使用dasatinib或ponatinib荧光示踪剂，同样观察到ponatinib与asciminib的负协同性弱于dasatinib。这一差异沿协同性谱分布，提示ponatinib较弱负协同性可能贡献于基于ponatinib的双位点抑制剂效力增强。

**连接子动态模拟**：原子级MD模拟显示，连接子平均RMSF与每原子熵估计强相关（R2=0.8）。在每个系列中，连接子RMSF随连接子长度和生化效力增加。在相似连接子长度下，PonatiLink-2化合物比PonatiLink-1具有更高的连接子RMSF，可能解释其增强的效力。这些结果提示，较长连接子和更直接的连接向量使双位点抑制剂在结合状态中连接子相对不受约束，从而降低结合熵成本。

**共价双位点EGFR抑制剂**：为评估适用性，研究人员设计了连接osimertinib（共价正构抑制剂）与变构抑制剂RO7304898的双位点EGFR抑制剂。OsimertiLink-1-PEG4（连接子过短无法同时结合同源原体）标记EGFR慢于乙酰化对照，而PEG11及更长连接子的化合物标记更快，表明双位点同时结合对活性至关重要。经优化连接化学的OsimertiLink-2标记EGFR最快，并在H1975细胞（EGFR^T790M/L858R驱动）中抑制细胞活力且对EGFR非依赖的A549细胞毒性极小，同时有效抑制EGFR通路磷酸化。

**PonatiLink-2对抗耐药突变**：在K562细胞BCR::ABL1饱和诱变文库中，ponatinib单药和asciminib单药在临床相关浓度下无法抑制文库增殖，而ponatinib联合asciminib有效抑制。PonatiLink-2在1 μM下即可抑制文库增殖。在单个临床相关突变细胞系中，PonatiLink-2对ponatinib临床耐药的E255V/T315I和T315M突变体的IC₅₀升高仅5.8倍和4.7倍（ponatinib为79倍和33倍），对asciminib高度耐药的V468F仅升高4.4倍。同时影响两个结合位点的复合突变（如T315M/V468F）仍高度耐药，表明PonatiLink-2通过抑制ABL1靶点起作用。在信号通路水平，PonatiLink-2抑制野生型BCR::ABL1的磷酸化效力与ponatinib联合asciminib相当，对E255V/T315I突变体的效力超过ponatinib和联合用药。

**PonatiLink-2的激酶组与细胞选择性**：在386种纯化人激酶SelectScreen面板中，ponatinib联合asciminib在IC₉₀浓度下抑制39种激酶（S_65%=0.10），包括与ponatinib血管毒性相关的FLT、VEGFR、PDGFR和FGFR家族。PonatiLink-2未抑制任何脱靶激酶超过38%（EPHA8），仅抑制ABL2（80%）。在健康人外周血单个核细胞集落形成实验中，PonatiLink-2和asciminib在10 μM以下毒性极小，而ponatinib和联合用药毒性显著。在865个细胞系的PRISM筛选中，三种化合物均选择性抑制ABL1融合驱动的细胞系，但PonatiLink-2比ponatinib更具选择性，仅抑制两个非ABL1驱动细胞系。在HUVEC模型中，PonatiLink-2对HUVEC与K562野生型BCR::ABL1的IC₅₀差异为9,100倍，优于asciminib（3,400倍）和ponatinib（120–140倍），提示其脱靶血管毒性较低。

**小鼠体内疗效**：在野生型BCR::ABL1 K562异种移植模型中，dasatinib单药（5 mg kg^–1口服，周一至周五）使8只小鼠中4只获得持久停药缓解，而dasatinib联合PonatiLink-2（100 mg kg^–1腹腔注射，每周两次）使8只小鼠全部获得持久停药缓解。在ponatinib耐药的BCR::ABL1^E255V/T315I异种移植模型中，ponatinib（30 mg kg^–1）无显著效果，而PonatiLink-2显著延长至肿瘤终点时间（P=0.004），6周给药期内无小鼠达到终点。耐药肿瘤分离的K562 PL2R细胞系中发现了两个新的自发突变G463D和E505K，均位于asciminib结合位点，且已知可赋予asciminib耐药，表明存在通过靶点内复合突变产生耐药的可能路径，但可能依赖单个突变，对双位点抑制剂相对脆弱。药代动力学分析显示，PonatiLink-2的C_max为8,820 nM，C_min为4,830 nM，远高于ponatinib（C_max 731 nM，C_min 42 nM），且无明显毒性，小鼠体重正常增长，提示治疗窗口显著扩大。

**讨论与结论**

研究系统阐明了双位点抑制剂的设计参数：连接子构象柔性有益于效力，较长连接子可减少结合熵成本；配体间协同性（负协同性的程度）是重要参数，ponatinib相较dasatinib的较弱负协同性可解释其双位点衍生物的优越表现。EGFR共价双位点抑制剂的研究进一步验证了连接子长度的阈值效应和设计的通用性。PonatiLink-2的改善选择性允许比ponatinib更高的系统暴露而无明显毒性，支持两种治疗策略：在野生型CML中，间歇性PonatiLink-2联合每日dasatinib可将持久停药缓解率从50%提高到100%；在复合突变CML中，每日PonatiLink-2单药有效治疗ponatinib高度耐药肿瘤。研究结论指出，双位点设计策略可推广至其他靶点，即使仅存在低亲和力配体，也可构建高效、选择性的治疗药物。该研究为多价分子设计提供了通用方法，有望促进效力强、耐受性好的ABL1及其他靶点抑制剂的开发。