基于原生质体转染与固态增殖的嗜热噬菌体TP-84基因组操控整合系统

《MicrobiologyOpen》：An Integrated System for Geobacillus Protoplast Formation, Transfection, Recombinant Genomes Rebooting, Efficient Propagation, and Genomic DNA Isolation of the Thermophilic Bacteriophage TP-84

　　

原生质体转化（protoplast transformation）一直是向芽孢杆菌属（Bacillus）物种导入质粒DNA的有效方法；然而，该方法此前尚未被证明可用于递送完整的噬菌体基因组。本研究描述了一种经优化且可重复的方法，用于形成嗜热脂肪土芽孢杆菌（Geobacillus stearothermophilus）原生质体，并高效转染（transfection）来自嗜热噬菌体TP-84的纯化重组或野生型基因组DNA。通过对关键参数的系统优化，包括细菌细胞密度、溶菌酶浓度、聚乙二醇（polyethylene glycol, PEG）类型与浓度以及DNA投入量，研究人员实现了稳健的噬菌体基因组DNA摄取及随后的感染性噬菌体颗粒产生。此外，研究人员优化并放大了一种单层固态噬菌体增殖（solid-state bacteriophage propagation）程序，并将其整合至TP-84基因组工程工作流程中，从而能够从单个培养皿中回收高滴度裂解液以及足量用于测序和后续基因组操作的基因组DNA。在本实验系统中，固态增殖相比液体细菌培养还提供了更高的重组噬菌体变体稳定性。综上，这些方法建立了一个基于原生质体的整合系统，涵盖噬菌体基因组DNA递送、重启（rebooting）、增殖与回收，从而能够对噬菌体基因组进行受控操作，并促进重组变体的快速生成与分析。

论文解读：基于原生质体转染与固态增殖的嗜热噬菌体TP-84基因组操控整合系统

一、研究背景与科学问题

嗜热噬菌体因其独特的分子生物学特性以及在分子生物技术领域的潜在应用而受到关注。TP-84（属于有尾噬菌体纲Caudoviricetes，Saundersvirus属）是一种感染嗜热脂肪土芽孢杆菌（Geobacillus stearothermophilus）的裂解性噬菌体，其基因组与蛋白质组已被系统表征，并被开发为热稳定噬菌体展示系统，可用于蛋白质工程、疫苗开发及环境治理等领域。然而，对感染革兰氏阳性菌的噬菌体进行基因改造存在显著困难。革兰氏阳性菌具有厚而致密的细胞壁，阻碍了工程化病毒基因组重新导入受体细胞，从而限制了噬菌体基因组重启（rebooting）的效率。目前用于噬菌体基因组工程的技术，如同源重组、电穿孔DNA重组工程、体内重组工程、CRISPR-Cas介导的基因组编辑、体外基因组重构、全基因组合成与组装等，大多仅适用于有限的常温噬菌体及其宿主体系。对于革兰氏阳性菌，三种主要转化方法——电穿孔、原生质体转化和三亲接合——均存在步骤繁琐、效率偏低等问题。值得注意的是，已有文献中关于芽孢杆菌属（Bacillus）、土芽孢杆菌属（Geobacillus）和副土芽孢杆菌属（Parageobacillus）原生质体转化的报道几乎全部集中于质粒DNA或用于同源重组的DNA片段的导入，尚无通过原生质体转化高效导入完整噬菌体基因组的报道。因此，开发一种能够将完整噬菌体基因组直接导入嗜热革兰氏阳性菌宿主细胞并实现高效重启的方法，对于推进嗜热噬菌体基因组工程具有重要意义。

二、研究内容与主要结论

针对上述问题，研究人员开发并系统优化了一套整合型原生质体转染系统，实现了TP-84噬菌体基因组DNA（包括天然基因组和全合成基因组）向G. stearothermophilus 10原生质体的高效递送与体内重启，并建立了配套的单层固态增殖与基因组DNA回收流程。该研究的主要结论包括：原生质体转染可有效用于直接导入噬菌体基因组DNA，显著拓展了该方法的适用范围；通过优化关键参数，感染性噬菌体颗粒产量较先前方案提高约130倍；固态增殖相比液体培养具有更高的重组噬菌体变体稳定性；整套流程可从单个培养皿中获得微克级TP-84基因组DNA，满足测序与后续基因组操作需求。该研究为嗜热噬菌体基因组工程提供了高效、可扩展的技术平台，并已成功应用于Parageobacillus genomosp. 1 NUB3621菌株，证明了其在不同宿主间的可转移性。

三、主要关键技术方法

研究人员采用的主要技术方法包括：原生质体制备与转染技术，通过溶菌酶消化G. stearothermophilus 10（链霉素抗性衍生物Gs10StrR）细胞壁形成原生质体，并结合聚乙二醇（PEG 4000）介导的DNA摄取实现噬菌体基因组转染；软琼脂覆盖层法（soft-agar overlay technique）用于噬菌体滴度测定与蚀斑计数；单层固态琼脂增殖系统，在方形培养皿中以高浓度宿主菌和适宜感染复数（MOI）实现噬菌体高效扩增；PEG/NaCl沉淀结合CsCl密度梯度超速离心进行噬菌体颗粒纯化；以及基于酶消化与硅胶柱层析的基因组DNA分离纯化方法。研究使用的宿主菌株为G. stearothermophilus 10（链霉素抗性）和Parageobacillus genomosp. 1 NUB3621。

四、研究结果

4.1 高效原生质体转染程序的开发

研究人员以Blanchard等人（2014）的质粒介导Geobacillus原生质体转化方案为基础，逐步建立了TP-84基因组DNA转染程序，并系统优化了多个关键参数，包括原生质体洗涤次数、溶菌酶浓度（0.02–0.2 mg/mL）与孵育时间（5–40 min）、宿主培养物生理状态（OD₆₀₀ 0.6–1.8）、用于原生质体制备的细菌数量（7.5×10⁸–3×10⁹ CFU）、基因组DNA用量（0.1–1.5 μg）与溶液体积（5–40 μL）、以及PEG分子量与浓度（PEG 4000、6000、8000和20000，浓度10%–40%）。结果表明：在测试范围内，培养密度（OD₆₀₀）在使用相同细菌数量时对结果无影响，因此需在分装前通过CFU/mL测定确定活菌数；用于原生质体制备的细菌样品应不超过7.5×10⁸–1.5×10⁹ CFU，溶菌酶终浓度应为0.02–0.08 mg/mL；原生质体的两步洗涤对去除残余溶菌酶至关重要；最高转染效率采用40% PEG 4000溶液和0.2–1 μg DNA，DNA溶液体积不应超过原生质体悬浮液体积的10%。在优化条件下，感染性TP-84噬菌体颗粒产量较先前方案提高约130倍。该程序还成功应用于Parageobacillus genomosp. 1 NUB3621菌株，证明其可转移性。

4.2 推荐的G. stearothermophilus 10原生质体制备与TP-84 DNA转染方案**

研究人员给出了最终优化的标准操作流程，分为两部分：第一部分为宿主细菌细胞沉淀的制备，包括培养Gs10StrR至OD₆₀₀ 0.6–1.5、离心收集、TMC缓冲液洗涤、分装后于?80°C冷冻保存，并在冷冻前测定活菌浓度以计算对应7.5×10⁸–1.5×10⁹ CFU的沉淀量；第二部分为原生质体制备与转染，包括解冻细胞沉淀、在含0.08 mg/mL溶菌酶的P培养基中37°C孵育30 min形成原生质体、洗涤后重悬于200 μL P培养基、加入0.2–1.0 μg噬菌体DNA和950 μL新鲜配制的40% PEG 4000溶液、室温孵育5 min、离心后重悬于300 μL P培养基并于55°C静置孵育1 h、加入200 μL新鲜宿主培养物（OD₆₀₀ 1.5–2.0）孵育10 min，最后以软琼脂覆盖层法铺板，55°C过夜培养后通过蚀斑形成评估转染效果。

4.3 固态增殖方法的开发与验证

为便于高效筛选新的重组噬菌体变体，研究人员优化并放大了单层固态增殖程序。该方法基于已有的琼脂平板噬菌体回收技术，对细菌投入量、感染复数（MOI）、琼脂体积、培养皿规格、噬菌体回收和基因组DNA分离进行了系统优化。最终方案为：将过夜宿主培养物以1/50稀释后于55°C振荡培养3–5 h至OD₆₀₀约2.0，离心后重悬于4 mL新鲜培养基；以MOI 0.3感染TP-84裂解液，55°C孵育10 min后与30 mL熔融顶层琼脂混合，倒入方形培养皿；55°C过夜培养至完全裂解；用25 mL TMC缓冲液淹没平板、破碎软琼脂并转移至离心管，12,000×g离心30 min（6°C）收集上清；剩余琼脂沉淀再以25 mL TMC缓冲液重悬、振荡1 h后再次离心，合并两次上清获得约60 mL最终裂解液。在优化条件下，单个方形平板上可高效感染约1.5×10¹⁰ CFU细菌（相当于35 mL OD₆₀₀为2.0的培养物），回收约60 mL滴度为5×10¹⁰ PFU/mL的噬菌体裂解液，总产量约3×10¹² PFU。实现高效增殖和完全裂解的关键参数是使用浓缩宿主培养物和适宜的MOI。该程序可从单块平板获得足量噬菌体材料，用于后续PEG 8000沉淀、可选CsCl梯度纯化及微克级基因组DNA分离。此外，实验观察表明，固态增殖相比液体培养对重组TP-84变体具有更高的稳定性。

4.4 固态增殖后的DNA分离

研究人员开发了配套的TP-84基因组DNA分离方法，包括：向合并的琼脂提取上清中加入NaCl至终浓度0.5 M和PEG 8000至5%（w/v），冰上孵育2 h后离心沉淀噬菌体颗粒；以TMC缓冲液重悬并离心去除残余PEG；加入DNase I（0.1 U/mL）和RNase A（0.1 μg/mL）于37°C孵育1 h消化污染核酸；加入SDS至0.1%（v/v）和蛋白酶K至0.25 mg/mL，于60°C孵育45 min去除蛋白质；加入两倍体积的5 M GuHCl/10 mM Tris溶液和等体积96%乙醇，4°C孵育30 min后离心沉淀DNA；以5 mM Tris–HCl（pH 7.5）重悬DNA沉淀，加入结合缓冲液和氯仿抽提后，通过硅胶微型柱纯化。根据起始裂解液滴度不同，该方案常规可获得5–20 μg无感染性噬菌体颗粒污染的纯化TP-84基因组DNA，其数量和质量足以满足DNA测序和第二轮原生质体转染等后续应用需求。

五、讨论与结论

本研究的讨论部分指出，与依赖完整噬菌体颗粒将遗传物质递送至细菌细胞的方法不同，原生质体转染能够直接将噬菌体基因组DNA导入宿主细胞，从而支持体外组装基因修饰噬菌体基因组的导入，简化了重组噬菌体的生成流程并缩短了获得噬菌体突变体所需时间。该程序成功应用于G. stearothermophilus 10和Parageobacillus genomosp. 1 NUB3621菌株，也可能为其他革兰氏阳性噬菌体-宿主系统建立基于原生质体的转染方法提供基础，但可能需要针对宿主和噬菌体进行特异性优化。此外，与液体细菌培养中的噬菌体增殖相比，固态增殖对重组噬菌体变体表现出更高的稳定性，表明该方法为维持噬菌体增殖过程中的遗传稳定性提供了更稳健的平台。

研究结论可归纳为以下四点：第一，本研究证明Geobacillus原生质体转化可用于直接导入噬菌体基因组DNA，显著扩展了该方法的应用范围，填补了此前缺乏通过原生质体高效导入完整噬菌体基因组报道的空白，表明原生质体可提供独立于天然病毒感染的功能性噬菌体研究平台。第二，为构建热稳定噬菌体展示系统，研究人员开发了获得重组TP-84噬菌体的高效技术，通过优化的原生质体转染程序导入重组DNA，在原生质体内形成重组噬菌体并感染完整宿主细胞，经PCR和免疫检测初步筛选后，在固体培养基中高效扩增、纯化并分离基因组DNA，从单个培养皿获得微克级TP-84 DNA，有效缩短了操作流程、节省了试剂，可在较短时间内测试多种噬菌体基因组修饰变体；迄今已获得30个稳定的重组噬菌体变体，包括在TP-84基因组多个位置引入功能性sfGFP编码基因，以及通过插入编码His标签和S标签的DNA序列对选定TP-84基因进行改造。第三，原生质体转染使体外组装的基因修饰噬菌体基因组能够直接导入宿主细胞，特别适用于噬菌体工程和功能基因组研究。第四，固态增殖相比液体培养对重组噬菌体变体具有更高的稳定性，为噬菌体增殖过程中的遗传稳定性维持提供了更稳健的平台。