mTORC1驱动结节性硬化症中星形胶质细胞的细胞自主反应性

《Nature》：mTORC1 drives cell-autonomous astrocyte reactivity in tuberous sclerosis

　　

结节性硬化症复合征(TSC)是一种遗传性神经发育障碍，以称为皮质结节(cortical tubers)的局灶性脑畸形为特征，这些结节与严重的难治性癫痫相关。结节被认为源于神经祖细胞中破坏TSC1或TSC2基因的体细胞二次打击突变，从而驱动mTORC1信号传导过度激活。结节中常观察到胶质细胞异常；然而，胶质细胞是主动致病还是仅仅源于慢性癫痫活动的结果，此前尚不清楚。为解决这一问题，研究人员使用了人脑类器官模型，在无癫痫发作的情况下追踪突变祖细胞的发育命运。研究人员在此表明，通过在人脑类器官和患者切除的结节组织中进行单细胞转录组学和循环免疫染色，TSC2缺失以一种细胞自主方式使神经祖细胞偏向分化为体积增大、促炎性的反应性星形胶质细胞(reactive astrocytes)。这些突变星形胶质细胞表现出谷氨酸转运体表达下调、炎症性细胞因子分泌增加，以及神经退行性疾病风险基因(如APOE和CLU)表达升高。研究结果表明，反应性星形胶质细胞是TSC2缺失的直接后果。这些结果将胶质功能障碍视为TSC发病机制的驱动因素，并强调反应性星形胶质细胞是TSC相关神经病理学的潜在治疗靶点。

结节性硬化症复合征(TSC)是一种由TSC1或TSC2基因突变引起的多系统发育障碍，以皮质发育畸形——即皮质结节——为特征，并与严重早发性癫痫相关。既往研究发现结节组织中含有异质性的异常细胞群体，包括发育不良神经元、胶质增生性星形胶质细胞、活化的小胶质细胞及巨细胞，且结节中富集星形胶质细胞相关基因并存在显著神经炎症。然而，由于结节切除手术仅在难治性癫痫患者中进行，胶质细胞变化究竟是癫痫的病因还是慢性癫痫发作的继发后果，一直没有明确结论。此外，结节病变内缺乏清晰的细胞类型标志物，巨细胞可同时表达祖细胞标志物以及神经元和胶质蛋白，进一步增加了研究难度。主流假说认为结节通过“二次打击”机制产生：携带种系杂合突变的患者，其神经祖细胞亚群获得体细胞突变而使剩余功能性TSC1或TSC2等位基因失活，导致TSC1-TSC2蛋白复合体功能丧失，进而引起mTOR复合体1(mTORC1)过度激活。二次打击祖细胞虽能存活和增殖，但其分化发育受损，形成局灶性异常细胞区域。为厘清胶质细胞在TSC病理中的因果角色，研究人员构建了携带TSC2条件敲除等位基因和Cre依赖性tdTomato报告基因的人脑类器官模型，通过慢病毒介导的Cre重组酶递送在类器官第8天模拟神经祖细胞中的二次打击突变，随后利用单细胞RNA测序(scRNA-seq)、循环免疫染色(4i)、免疫淘选、蛋白质印迹、细胞因子芯片及图像UMAP分析等多种技术手段，系统追踪了突变细胞的发育命运并表征其分子和形态学特征。

研究人员的主要技术方法包括：基于WIBR3人胚胎干细胞(hES)系、BJ人诱导多能干细胞(hiPS)系以及8858和8119两个等基因hiPS系构建脑类器官模型；使用10x Genomics平台进行单细胞转录组测序并将数据映射至胎儿脑组织图谱以鉴定细胞类型；采用荧光激活细胞分选(FACS)分离TSC2^?/?与TSC2^c/?细胞；对患者切除的结节组织进行多重循环免疫染色(4i)和图像UMAP无偏分析；利用HepaCAM抗体免疫淘选纯化星形胶质细胞；并使用rapamycin和Torin1进行mTOR抑制剂干预实验。患者样本来自8名接受手术治疗的TSC患者共10个皮质结节标本。

### TSC2^?/?细胞优先产生星形胶质细胞

通过对第50天(神经发生期)、第120天(早期胶质发生期)和第220天(细胞成熟期)的类器官进行scRNA-seq分析，研究人员发现TSC2^?/?细胞相比同一类器官中的TSC2^c/?细胞，显著偏向分化为胶质谱系细胞(GLC)，包括胶质中间祖细胞(gIPC)、星形胶质细胞偏好的gIPC和少突胶质细胞偏好的gIPC等。这种胶质细胞分化偏倚在第50天即可观察到，并随时间推移更加显著。对照实验表明，单等位基因TSC2缺失(TSC2^c/+)不产生形态异常、胶质分化偏倚或S6磷酸化增加，证明双等位基因失活是产生结节样细胞所必需的。

### TSC2^?/?星形胶质细胞表达反应性基因

差异表达分析显示，TSC2^?/?星形胶质细胞中反应性星形胶质细胞基因模块评分在全部时间点均显著升高，涉及SERPINA3、CD44、CCL2、CTSH、CRYAB和S100A11等基因；同时自噬诱导模块(含SQSTM1/p62)表达上调。TSC2^?/?星形胶质细胞还表现出神经炎症和免疫信号、抗氧化反应、细胞外基质重塑及脂质代谢等转录水平改变。在BJ hiPS细胞系来源的类器官中，这些结果得到重复验证，且TSC2^?/?细胞更倾向于分化为星形胶质细胞而非少突胶质细胞前体。

### TSC1^?/?和TSC2^?/?类器官胶质生成增加

研究人员在TSC1^?/?和TSC2^?/?类器官中均观察到mTORC1激活，表现为S6和4EBP1磷酸化水平升高，且星形胶质细胞/神经元比率显著增加。TSC2^?/?类器官的批量RNA-seq证实GFAP、CLU、CRYAB、APOE和SQSTM1表达升高，而神经元基因表达降低。

### TSC2^?/?星形胶质细胞蛋白表达和分泌谱改变

免疫荧光和蛋白质印迹分析显示，TSC2^?/?类器官中GFAP、S100β、clusterin、p62、αB-晶状体蛋白(CRYAB)、连接蛋白43(Cx43)和钾通道Kir4.1表达升高，而星形胶质细胞谷氨酸转运体EAAT1表达显著下调。细胞因子芯片检测发现TSC2^?/?类器官在非刺激条件下分泌更高水平的GDF15、CHI3L1、CCL2、SERPINE1、HGF、CSF1、MIF和IGFBP2等炎症和损伤相关因子。

### TSC2^?/?星形胶质细胞形态异常和纯化后性质改变

全器官成像显示TSC2^?/?星形胶质细胞细胞体显著增大、主突起增粗且细分支减少。免疫淘选纯化的TSC2^?/?星形胶质细胞中出现多核化细胞(最多含17个细胞核)，并单细胞水平高表达S100β、GFAP、CRYAB、vimentin、clusterin和APOE，Ki67阳性率无差异，表明并非增殖增加所致。

### mTOR抑制部分逆转TSC2^?/?星形胶质细胞表型

用mTORC1抑制剂rapamycin或mTORC1/mTORC2双重抑制剂Torin1处理免疫淘选后的星形胶质细胞7天，可降低p-S6、clusterin、APOE和p62水平，并使TSC2^?/?星形胶质细胞在图像UMAP空间中向中间状态偏移，但未完全恢复至野生型状态。

### 结节细胞显示反应性星形胶质细胞特征

对8例TSC患者共10个切除结节标本进行循环免疫染色，发现结节中p-S6高表达的细胞更倾向于表达S100β、nestin和vimentin等反应性星形胶质细胞标志物，且APOE、clusterin、CRYAB和p62表达水平更高，而不富集神经元标志物NeuN或HuC/D。图像UMAP分析从117,901个细胞中无偏识别出一个由385个高p-S6细胞组成的异常细胞簇，其蛋白表达谱与体外TSC2^?/?反应性星形胶质细胞高度一致，包括p62、vimentin、CRYAB、S100β、nestin、APOE、GFAP、PTGDS和clusterin升高，HuC/D和MAP2降低。

在讨论中，研究人员指出胶质病理在皮质发育畸形中一直被报道，但此前无法区分其是慢性癫痫的原因还是后果。本研究表明，双等位基因TSC2缺失导致的mTORC1激活足以在周围细胞不具反应性的条件下诱导过早胶质发生和反应性；由于类器官缺乏小胶质细胞、血管细胞和外周免疫细胞，这一表型的细胞自主性得以明确。研究人员强调，结节中mTORC1高度激活的细胞虽占比不足1%，但这些反应性星形胶质细胞可通过谷氨酸摄取功能缺失和炎症性细胞因子分泌等机制对周边广泛细胞群体产生非细胞自主效应，与获得性癫痫中反应性星形胶质细胞足以驱动癫痫发生的证据相符。研究还揭示了TSC与神经退行性疾病(如阿尔茨海默病)之间的潜在共同机制：本研究鉴定的多个差异表达基因(如CLU和APOE)与阿尔茨海默病风险相关，mTORC1失调和SQSTM1/自噬异常也广泛涉及神经退行性疾病。研究人员总结认为，TSC1-TSC2功能障碍触发了具有神经炎症潜力的自主反应性星形胶质细胞的产生；由于这些细胞在皮质发育早期即出现，它们是TSC神经病理生理学的原发性驱动因素，而非慢性癫痫的单纯继发现象。mTORC1调节星形胶质细胞反应性的机制及逆转策略值得深入研究，具有重要治疗潜力。