组蛋白去甲基化酶JMJD2通过调控rDNA转录与核仁完整性影响稻瘟病菌发育及致病性

《Molecular Plant Pathology》：The Histone Demethylase JMJD2-Dependent Regulation of rDNA Transcription and Integrity of Nucleolus Is Required for Fungal Development and Pathogenicity in the Rice Blast Fungus

　　

核仁是细胞核功能的核心枢纽，在哺乳动物和出芽酵母中涉及核糖体生物发生等多种功能。然而，核仁在真菌中如何被调控并参与真菌发育与致病过程，目前知之甚少。本文报道含JmjC结构域的组蛋白去甲基化酶MoJMJD2是稻瘟病菌（Magnaporthe oryzae）rDNA转录和核仁完整性所必需的。MoJMJD2通过选择性剪接产生两种亚型，二者具有不同的亚细胞定位模式，提示其在核仁和核质中的基因调控中发挥协同作用。敲除MoJMJD2导致真菌菌丝生长、产孢和致病性缺陷。值得注意的是，MoJMJD2缺失导致核仁蛋白错误定位至核质，并引起细胞蛋白质合成显著下降，提示功能性核仁结构遭到破坏。综上，这些结果表明，受MoJMJD2相关表观遗传调控的核仁完整性与功能，是稻瘟病菌发育和致病性所必需的。

论文解读

一、研究背景与科学问题

核仁是真核细胞核内一种无膜包裹的区室结构。过去数十年的研究表明，核仁不仅是核糖体工厂，更是参与细胞核多种功能的多功能结构域。核仁的大小和活性会随细胞周期、细胞应激及代谢状态发生动态变化，其功能高度依赖于进出核仁的蛋白质组成。在酵母和动物细胞中，TOR蛋白激酶是连接营养状况与核仁活性的重要调控因子，营养缺乏或雷帕霉素处理均会导致核仁体积和活性下降。在核仁中，rDNA转录受到组蛋白甲基化等表观遗传机制的精细调控，组蛋白甲基转移酶（HMTs）与去甲基化酶（HDMs）之间的动态平衡决定了活跃rDNA位点的数目及转录效率。JmjC结构域家族去甲基化酶（JMJD）可去除单、二、三甲基化状态的赖氨酸甲基修饰，其中KDM4家族主要靶向H3K9me2/3和H3K36me2/3。在丝状真菌中，组蛋白甲基化/去甲基化已被证实在次级代谢基因簇调控、基因组稳定性和致病性中发挥重要作用，但在稻瘟病菌中，核仁如何被表观遗传调控并参与真菌发育和致病过程，此前尚不清楚。稻瘟病每年造成全球水稻产量损失约10%–30%，深入研究其致病机制具有重要的农业意义。本研究旨在揭示组蛋白去甲基化酶MoJMJD2是否通过调控rDNA转录和核仁完整性来影响稻瘟病菌的发育与致病性。

二、研究内容与主要结论

研究人员在稻瘟病菌中鉴定到MoJMJD2基因（MGG_09186），该基因编码KDM4家族组蛋白赖氨酸去甲基化酶，通过选择性剪接产生两种mRNA亚型——长型MoJMJD2T⁰和短型MoJMJD2T¹。两种亚型的表达比例受环境条件调控，在促进产孢条件下MoJMJD2T¹转录本相对丰度显著升高。亚细胞定位分析显示，MoJMJD2T⁰含有C末端核仁定位序列（NoLS），定位于核仁；而MoJMJD2T¹缺少该序列，在菌丝中定位于细胞核。通过基因敲除、染色质免疫沉淀（ChIP）、实时定量PCR（RT-qPCR）和蛋白质合成检测等手段，研究人员证实MoJMJD2T⁰直接结合rDNA启动子区域，通过调控H3K9me1水平促进rDNA转录；MoJMJD2缺失导致rRNA水平急剧下降、细胞蛋白质合成显著减少、核仁完整性破坏，进而引起菌丝生长、产孢和致病性等多方面缺陷。该研究首次在丝状真菌中揭示了核仁的表观遗传调控机制，证明核仁功能与完整性是真菌发育和致病所必需的。

三、主要关键技术方法

本研究采用基因靶向敲除技术，通过双接头PCR（double-joint PCR）构建敲除载体，以潮霉素抗性基因（HPH）替换MoJMJD2基因，并经反向PCR和Southern印迹验证正确替换。利用反转录定量PCR（RT-qPCR）分析基因表达和rRNA水平；采用染色质免疫沉淀结合定量PCR（ChIP-qPCR）检测MoJMJD2T⁰在rDNA位点的富集及组蛋白甲基化修饰状态；通过SUnSET实验（表面传感翻译检测）评估新生蛋白质合成速率；借助荧光显微技术观察融合蛋白的亚细胞定位和核仁形态。此外，通过水稻叶片接种和稻瘟病菌水稻鞘细胞侵染实验评估致病性。野生型菌株KJ201来自韩国真菌遗传资源中心（CFGR）。

四、研究结果

2.1 MoJMJD2通过环境依赖性选择性剪接产生两种mRNA：通过cDNA测序确认MoJMJD2产生两种剪接变体，短型缺少C末端NoLS。RT-qPCR分析显示两种变体在不同条件下差异积累，MoJMJD2T¹在促进产孢条件下丰度显著升高，提示其可能参与无性繁殖。

2.2 MoJMJD2T⁰和MoJMJD2T¹分别定位于核仁和细胞核：荧光共定位实验表明，MoJMJD2T⁰-GFP与核仁标记蛋白MoNOP1-RFP共定位，确认其为核仁蛋白；MoJMJD2T¹-GFP在组成型启动子驱动下与H1-RFP重叠，定位于细胞核。在孢子萌发和附着胞形成过程中，MoJMJD2T⁰的定位发生动态变化，从核仁转移至斑点结构并最终出现在细胞外周。

2.3 MoJMJD2通过表观调控rDNA转录维持蛋白质合成稳态并保证核仁完整性：雷帕霉素处理显著降低MoJMJD2转录水平，提示其位于TOR激酶信号下游。ΔMojmjd2突变体中rRNA水平低于雷帕霉素处理的野生型。ChIP-qPCR显示MoJMJD2T⁰富集于rDNA启动子、18S和26S区域。突变体rDNA位点H3K9me1显著富集而H3K9ac减少。SUnSET实验表明突变体新生蛋白质合成大幅降低。突变体中核仁蛋白MoNOP1错误定位至整个细胞核，表明核仁完整性被破坏。

2.4 MoJMJD2是营养生长、无性发育和致病性所必需的：ΔMojmjd2菌落直径减少38%，气生菌丝厚度减少66%，产孢量急剧下降。致病性实验显示突变体病斑面积减少超过60%，水稻鞘细胞侵染实验表明其穿透和侵入性生长均受损。突变体对H₂O₂和裂解酶高度敏感。野生型MoJMJD2回补可完全恢复所有表型缺陷。单独表达MoJMJD2T⁰可部分恢复生长和产孢，MoJMJD2T¹单独表达不能恢复生长缺陷，两种亚型共表达效果优于单独表达，但均未完全恢复至野生型水平。

2.5 MoJMJD2依赖的组蛋白去甲基化与核基因转录调控：突变体中黑色素合成相关8个基因全部下调，其中5个基因启动子区H3K9me1富集。产孢相关13个基因中多数下调超过2倍，部分基因启动子区H3K9me1和H3K36me3富集。细胞壁合成相关9个基因中7个在突变体中下调，其启动子区H3K9me1显著富集。ChIP实验未检测到MoJMJD2T¹在这些核基因启动子区的富集，提示其可能间接调控这些基因的转录。

五、讨论与结论

研究讨论指出，MoJMJD2属于进化上保守的KDM4家族去甲基化酶，与构巢曲霉（Aspergillus nidulans）的KdmA最为接近。尽管典型的KDM4家族成员以H3K9me3/H3K36me3为主要底物，但本研究发现MoJMJD2在rDNA位点主要调控H3K9me1水平，提示其底物偏好可能与相关真菌去甲基化酶存在差异。MoJMJD2通过选择性剪接产生定位不同的两种亚型，实现对核仁rDNA转录和核基因表达的时空协调调控。MoJMJD2T⁰定位于核仁，通过去除H3K9me1激活rDNA转录；MoJMJD2T¹定位于细胞核，可能通过间接机制调控核基因表达。TOR激酶可能位于MoJMJD2上游，雷帕霉素处理可降低MoJMJD2转录。突变体致病性下降与附着胞介导的穿透缺陷和侵入性生长受损有关，对活性氧（ROS）和细胞壁应激的敏感性增加可能是侵入性生长受限的原因之一。研究还推测，MoJMJD2T⁰在附着胞形成过程中的动态重定位可能涉及核仁应激反应或自噬相关机制，但这些推测有待进一步验证。

研究结论：本研究揭示了MoJMJD2在稻瘟病菌核仁内表观遗传调控中的新角色。MoJMJD2通过选择性剪接产生两种亚型，实现功能多样性和环境依赖性的空间协调：MoJMJD2T⁰进入核仁，通过降低H3K9me1水平激活rDNA转录；MoJMJD2T¹定位于细胞核。MoJMJD2缺失破坏核仁完整性，导致核仁蛋白错误定位，并严重影响营养生长、无性繁殖、附着胞介导的穿透和侵入性生长。该研究建立了核仁功能/完整性与真菌发育/致病性之间的密切联系，提示核仁功能及其调控相关组分可能成为作物病害防控策略的潜在靶点。