新橙皮苷通过Mettl3-m6A-Nrf2信号通路缓解阿霉素诱导心脏毒性中的铁死亡

《Phytotherapy Research》：Neohesperidin Alleviates Ferroptosis in Doxorubicin-Induced Cardiotoxicity via Mettl3-m6A-Nrf2 Signaling

　　

阿霉素（Doxorubicin，DOX）具有抗肿瘤功效，但其临床应用受到多种副作用的限制，尤其是心脏毒性。新橙皮苷（neohesperidin）是柑橘类水果中的一种黄酮类化合物，具有多种健康益处。本研究旨在探讨新橙皮苷对阿霉素诱导的心脏毒性（DOX-induced cardiotoxicity，DIC）的心脏保护作用及其机制。研究人员采用DOX处理的小鼠评估心脏功能和心肌细胞损伤；此外，使用DOX处理的原代心肌细胞测量细胞活力和死亡；并使用铁死亡抑制剂FIN56检验新橙皮苷的有益作用与铁死亡之间的关系。随后开展机制研究，以探讨N6-甲基腺苷（N6-methyladenosine，m6A）水平、核因子E2相关因子2（nuclear factor erythroid-2-related factor 2，Nrf2）表达以及甲基转移酶样3（Methyltransferase-like 3，Mettl3）在新橙皮苷心脏保护作用中的角色。研究人员还进行了Mettl3的过表达和敲低，以确认其在心脏保护作用中的作用。结果表明，新橙皮苷改善了DOX处理小鼠的心脏功能和心肌细胞损伤；通过减少活性氧和丙二醛水平、增加超氧化物歧化酶和谷胱甘肽水平，减轻了DOX诱导的氧化应激，并恢复了ATP生成。在DOX处理的原代心肌细胞中，新橙皮苷增加了细胞活力并减少了细胞死亡，而FIN56消除了新橙皮苷的有益作用。机制上，新橙皮苷降低m6A水平，导致Nrf2表达增加；Nrf2激活与抑制Mettl3（一种m6A“写入器”）有关，从而保护心肌细胞免受DOX诱导的铁死亡。过表达Mettl3可逆转新橙皮苷的心脏保护作用，并削弱其对铁死亡的益处。这些发现表明，新橙皮苷通过抑制铁死亡对DIC发挥心脏保护作用，该效应通过调节Mettl3-m6A-Nrf2信号通路实现，提示新橙皮苷的治疗潜力。

阿霉素（DOX）作为蒽环类抗生素广泛用于实体瘤和血液系统肿瘤化疗，但心脏毒性严重限制其临床应用。目前唯一获批的防治药物右雷佐生（Dex）可能增加继发性恶性肿瘤风险，因此亟需更安全有效的替代策略。铁死亡是一种铁依赖性活性氧（ROS）积累驱动的调控性细胞死亡形式，已被认为是DIC的重要致病机制。DOX可破坏心肌铁稳态，抑制GPX4、SOD、GSH等抗氧化因子，导致脂质过氧化物蓄积。Nrf2是调控抗氧化基因表达的关键转录因子，其激活可抑制铁死亡，但上游调控机制尚不明确。新橙皮苷是柑橘类水果中含量丰富的黄酮类化合物，具有抗氧化、抗炎等多种生物活性，但能否改善DIC及其分子机制此前未见报道。m6A是真核细胞mRNA上最丰富的化学修饰，其催化核心Mettl3是否通过介导Nrf2 mRNA的m6A甲基化参与DIC调控，是本研究的核心科学问题。

研究人员采用DOX处理的小鼠模型和新生小鼠原代心肌细胞模型，系统评估了新橙皮苷对心脏功能、心肌损伤、氧化应激和铁死亡的影响，并通过Mettl3敲低/过表达及铁死亡激动剂FIN56干预验证分子机制。结果表明，新橙皮苷通过抑制Mettl3介导的Nrf2 mRNA m6A甲基化，恢复Nrf2表达，进而激活SLC7A11/GSH/GPX4抗氧化轴，抑制心肌细胞铁死亡，最终减轻DIC。该研究首次揭示新橙皮苷以Mettl3-m6A-Nrf2信号通路为靶点拮抗心肌铁死亡，为天然黄酮类化合物防治化疗相关心脏损伤提供了新理论依据。

在技术方法层面，研究人员使用SPF级雄性C57BL/6小鼠（8周龄，由广州中医药大学提供）建立DIC模型，通过尾静脉注射DOX（5 mg/kg，每周1次，共4周）；新橙皮苷（50、100 mg/kg）灌胃给药，Dex（30 mg/kg）作为阳性对照。原代心肌细胞取自新生（2–3天）小鼠，经DOX（1 μM）±新橙皮苷（10、20 μM）处理。机制验证采用FIN56（GPX4抑制剂）、Mettl3敲低/过表达慢病毒（体外）以及心脏特异性AAV9-Mettl3（体内）。主要检测手段包括超声心动图、H&E/WGA/TUNEL染色、透射电镜（TEM）、CCK-8、流式细胞术（ROS、Fe²⁺、BODIPY、细胞死亡）、生化试剂盒（MDA、SOD、GSH/GSSG、ATP）、qRT-PCR、m6A定量、Me-RIP和Western blot。

3.1 新橙皮苷保护DIC：超声心动图显示DOX小鼠EF和FS显著下降，新橙皮苷呈剂量依赖性逆转；H&E染色证实其减轻心肌结构紊乱和炎性浸润，WGA染色显示其抑制心肌细胞肥大，TUNEL结果提示其减少心肌细胞死亡；同时新橙皮苷降低ANP、BNP、β-MHC mRNA水平及血清cTnT、CK-MB含量，表明其具有明确的心脏保护作用。

3.2 新橙皮苷减轻DOX诱导的心肌氧化应激：荧光染色显示新橙皮苷降低心肌ROS水平，生化检测显示其降低MDA、升高SOD并恢复ATP含量，提示氧化应激损伤得到缓解。

3.3 新橙皮苷抑制体外DOX诱导的心肌细胞损伤：CCK-8显示10和20 μM新橙皮苷显著提高DOX处理原代心肌细胞的存活率，降低ANP、BNP、β-MHC转录水平，减少细胞死亡率，恢复ATP并下调ROS和MDA、上调SOD，证实其体外保护效应。

3.4 新橙皮苷在体内外抑制DOX诱导的心肌铁死亡：透射电镜显示新橙皮苷改善DOX引起的线粒体肿胀和嵴破坏；其上调FTH1、GPX4、SLC7A11并下调ACSL4、PTGS2，同时升高GSH/GSSG比值；铁死亡激动剂FIN56可显著取消新橙皮苷对GSH/GSSG、Fe²⁺积累和脂质过氧化的改善作用，证明其核心效应依赖于抑制铁死亡。

3.5 Mettl3-m6A-Nrf2信号驱动DOX刺激心肌细胞的铁死亡：DOX处理使心肌组织和原代细胞中Mettl3蛋白和m6A水平增加，Nrf2 mRNA的m6A富集上升而Nrf2蛋白下降；Mettl3敲低可阻断m6A升高并恢复Nrf2表达，同时提高FTH1、GPX4、SLC7A11并抑制ACSL4、PTGS2，表明Mettl3-m6A-Nrf2信号是DIC铁死亡的关键驱动因素。

3.6 新橙皮苷通过调节Mettl3-m6A-Nrf2信号减轻心肌细胞铁死亡：Western blot和Me-RIP显示新橙皮苷降低Mettl3和总m6A水平，减少Nrf2 mRNA的m6A甲基化，进而恢复Nrf2表达，说明该通路介导其药效。

3.7 Mettl3过表达消除新橙皮苷对DOX诱导铁死亡的抑制作用：在Mettl3过表达的原代心肌细胞中，新橙皮苷无法再恢复Nrf2，也无法上调GPX4和SLC7A11或下调ACSL4和PTGS2；细胞死亡、MDA、BODIPY和Fe²⁺水平均未改善，证实Mettl3是新橙皮苷发挥抗铁死亡作用的必要靶点。

3.8 Mettl3过表达废除新橙皮苷对DOX诱导心脏损伤的体内保护作用：AAV9介导的心脏Mettl3过表达使新橙皮苷不再改善EF、FS，也无法减轻心肌结构损伤和肥大，ROS水平恢复至损伤水平，ANP、BNP、β-MHC、cTnT和CK-MB均回升，进一步确证该通路在体内的重要性。

在讨论部分，研究人员指出铁死亡是DIC中细胞死亡的重要形式，SLC7A11/GSH/GPX4轴的抑制与ACSL4、PTGS2的激活共同导致脂质过氧化。新橙皮苷通过恢复该抗氧化轴抑制铁死亡，FIN56消除其保护作用支持这一结论。Nrf2作为上游转录因子调控该轴，而本研究发现的Mettl3介导的m6A修饰是Nrf2表达下调的上游事件。Mettl3敲低和过表达实验双向证实了该因果关系。研究人员还讨论到，小鼠100 mg/kg新橙皮苷经体表面积换算对应人体等效剂量约为8.10 mg/kg，且未见明显毒副作用，但肝肾功能损伤患者应用时需谨慎，长期用药安全性尚待考察。研究结论部分翻译如下：新橙皮苷通过抑制体内外铁死亡发挥心脏保护作用，其机制归因于降低Mettl3介导的Nrf2 mRNA m6A甲基化，从而恢复Nrf2表达及下游抗氧化防御，提示新橙皮苷可能成为改善DIC的有效膳食补充剂。