《Plant, Cell & Environment》：Integrated Analysis of Grapevine Responses to Winter Pruning Reveals Temperature-Associated, Polyphenol-Rich Xylem Occlusions
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摘要翻译：多年生作物在栽培过程中持续遭受创伤。为限制病原菌侵染和组织脱水，植物进化出一系列保护受损组织的创伤响应机制，包括基因表达变化以及多酚等保护性化合物的合成。此外，植物在创伤和病原菌感染后会对受损的木质部导管进行堵塞，形成凝胶（gel）、树胶（gum）和
摘要翻译：多年生作物在栽培过程中持续遭受创伤。为限制病原菌侵染和组织脱水，植物进化出一系列保护受损组织的创伤响应机制，包括基因表达变化以及多酚等保护性化合物的合成。此外，植物在创伤和病原菌感染后会对受损的木质部导管进行堵塞，形成凝胶（gel）、树胶（gum）和胼胝体（tylose）等结构。研究人员探讨了葡萄树对修剪的响应。首先，研究人员检测了木质部导管堵塞物在不同时间点和距离伤口表面不同深度处的形成动态。其次，研究人员表征了修剪响应的转录变化和多酚积累情况。最后，研究人员利用拉曼显微镜解析了木质部导管堵塞物的空间化学成分。研究人员发现，冬季木质部导管堵塞响应与气温密切相关。此外，拉曼显微镜证明这些堵塞物为富含芪类化合物（stilbenoid）和黄酮类化合物（flavonoid）的凝胶状或树胶状结构。堵塞物中多酚的积累与芪合酶（stilbene synthase）基因的上调表达以及芪类化合物的积累和寡聚化有关。总体而言，本研究结合组织学、代谢组学、转录组学和光谱学方法，对多年生木本组织对冬季修剪的响应进行了整合表征，并揭示了温度在木质部导管堵塞物形成和动态变化中的潜在调控作用。
论文解读
一、研究背景与目标
多年生作物在栽培过程中不可避免地遭受机械创伤，如修剪、嫁接和采收等。为应对创伤，植物进化出复杂而协调的防御机制，涵盖从局部细胞信号传导到系统代谢重编程的多个层面。创伤首先导致细胞破裂，受损细胞释放的信号分子触发防御激素途径，包括茉莉酸（jasmonic acid, JA）、乙烯（ethylene, ET）和水杨酸（salicylic acid, SA）通路的协同激活，进而调控创伤响应基因的表达。在拟南芥、水稻等草本植物中，创伤响应的早期转录事件已被较为系统地描述，但对木本植物而言，创伤响应的转录组研究仍相对有限，且现有研究多集中于整体组织的分析而缺乏组织或细胞类型特异性的分辨。
在形态和化学层面，植物在创伤和病原菌侵染后会对受损的木质部导管进行物理性封堵，形成凝胶、树胶和胼胝体等堵塞结构。这些堵塞物主要由导管周围薄壁细胞产生，可有效阻止病原菌扩散和组织脱水。凝胶是富含果胶的水合胶体，通常在受伤后迅速形成；随时间推移，凝胶脱水形成树胶，成为更致密的无定形沉积物，富含多糖和酚类化合物；胼胝体则是相邻薄壁细胞向导管腔内膨大形成的结构。尽管这些堵塞结构的形成对植物抗病性至关重要，尤其是在葡萄树干病害如埃斯卡病（Esca）和柑桔斑霉病菌（Phaeomoniella chlamydospora）感染的防治中，但对其分子调控机制和化学组成的了解仍然十分有限。此前的研究（Sun et al., 2008）表明，葡萄树维管束堵塞物的类型存在季节性差异——冬季以凝胶为主，夏季以胼胝体为主，但缺乏对不同品种、不同采样深度和较长时间跨度下的系统性研究。此外，堵塞物因难以从周围组织中分离而限制了其成分鉴定，尽管传统组织化学染色有助于初步表征，但缺乏细胞尺度下的化学分辨率。
本研究旨在从多维度整合表征葡萄树（Vitis vinifera）两个不同基因型对冬季修剪的创伤响应，涵盖木质部薄壁组织的基因表达变化、次生代谢物积累、木质部导管堵塞物形成动态及其化学组成。研究人员特别关注温度对这些响应的潜在调控作用，以期构建温度依赖性的堵塞形成模型，为优化修剪策略和培育抗病品种提供理论基础。
二、研究技术与方法
研究人员在法国波尔多地区进行了系统的田间试验。试验涉及两个葡萄品种——'Chardonnay'（霞多丽）和'Cabernet franc'（品丽珠），试验分设于圣路易四世（Saint Louis IV）葡萄园（1988年定植，砧木为Gravesac）和波尔多葡萄酒与葡萄栽培实验设施（2010年定植，砧木为SO4）。研究采用五种互补的技术路径：其一，组织学动态分析，利用GSL1切片机对修剪伤口下方2 mm和10 mm处制作约20 μm厚度的横切面切片，经甲苯胺蓝染色后在体视荧光显微镜下观察并统计木质部导管堵塞比例，并采用广义线性混合模型（glmmTMB）进行分析；其二，多酚代谢组学分析，使用高效液相色谱对修剪后0、21、42天的木质部碎片进行多酚提取和定量，结合主成分分析（PCA）和置换多元方差分析（PERMANOVA）进行多变量统计分析；其三，转录组分析，采用DNBseq平台进行RNA测序（RNA-seq），以V. vinifera v4参考基因组为比对基础，利用STAR比对和Salmon定量，通过edgeR准似然F检验鉴定差异表达基因，并进行基因本体论（GO）和MapMan通路富集分析；其四，拉曼显微光谱分析，利用配备785 nm激光的共聚焦拉曼显微镜（alpha300RA，WITec）对15 μm厚的冷冻切片进行化学成像，通过真实成分分析（True Component Analysis, TCA）解析堵塞物和各细胞壁区域的化学成分分布；其五，气候关联分析，从距离试验园200 m的气象站获取气温数据，计算修剪期每日平均温度的累积和，将其与木质部导管堵塞增加百分比进行线性回归和多元线性回归分析，以评估温度对堵塞形成的贡献。
三、主要研究结果
3.1 冬季完整茎段中木质部导管堵塞比例在基因型间差异较小且总体呈增加趋势
通过光学显微镜，研究人员在葡萄茎段的横切面和纵切面中清晰观察到了木质部导管堵塞物。在未受伤的对照样品（T0）中，堵塞物的基础水平存在基因型差异：在11月的第一试验期，'Chardonnay'的导管堵塞比例显著高于'Cabernet franc'。随着冬季时间推移，未受伤茎段中的堵塞物比例总体呈逐渐增加的趋势，表明木质部堵塞的形成不仅是对创伤的响应，还可能受到冬季发育和环境因素的驱动。
3.2 冬季修剪触发与温度相关的木质部导管堵塞物形成
修剪伤口诱导的导管堵塞形成表现出显著的季节依赖性和深度依赖性。11月修剪后，两个品种在伤口下方2 mm和10 mm处的堵塞比例在T0至T14期间均显著增加，随后T14至T28期间保持稳定。1月修剪诱导的堵塞形成幅度较小，但两个品种在10 mm深度处于T14至T28期间仍有显著增加。3月修剪则在'Cabernet franc'中诱导了大量堵塞物的形成。值得注意的是，在多数情况下，距伤口10 mm处的堵塞诱导程度高于2 mm处，这与此前研究（Sun et al., 2008）报告的2 mm处堵塞更多的结果不同，可能反映了局部气候对堵塞形成和脱水过程的调控作用。
关键发现是堵塞物形成的增加幅度与修剪后累积日平均气温之间存在显著相关性。线性回归分析显示，'Cabernet franc'在2 mm和10 mm深度处以及'Chardonnay'在10 mm深度处的堵塞增加百分比与累积温度显著相关。多元线性回归模型整体显著（F?,??? = 14.12，p < 0.001），解释了46.0%的堵塞变化方差。模型中，累积温度对堵塞形成有显著影响（p = 0.041），季节因素亦显著（p = 0.003），距伤口深度的影响最强（p < 0.001），而基因型和创伤后时间的影响不显著。这一结果强有力地支持了温度对修剪诱导的木质部堵塞形成的部分调控作用，其规律类似于基于积温模型预测的芽萌发过程。
3.3 多酚在冬季修剪伤口响应中积累
对多酚代谢组的PCA分析显示，两个品种在PC1轴上明显分离（PC1解释34.2%的变异），'Chardonnay'与芪类化合物（如r-viniferin、r2-viniferin和cis-astringin）相关联，而'Cabernet franc'则与黄烷醇类化合物（包括表儿茶素、表没食子儿茶素和没食子儿茶素）相关联。随着创伤时间的推移，ω-viniferin、pallidol、ε-viniferin和miyabenol-C等化合物在两个品种的受伤组织中均逐渐积累。仅有三个代谢物表现出显著的基因型×时间互作效应：naringenin（柚皮素）在'Chardonnay'中于T21时特别积累，ω-viniferin在'Chardonnay'中浓度更高，而a-viniferin则在'Cabernet franc'中积累更多。
从芪类化合物的寡聚化动态来看，芪单体在0至21天快速增加，且在'Chardonnay'中增幅更大，之后趋于稳定；二聚体和三聚体在0至42天呈线性增加，尤以'Chardonnay'中的二聚体增幅显著；四聚体仅在21天后开始显著增加，且在'Cabernet franc'中的浓度通常高于'Chardonnay'。这一时序模式揭示了芪类化合物寡聚化在伤口响应中逐步推进的生化过程。
3.4 拉曼成像揭示木质部导管堵塞物的化学组成
拉曼显微成像在'Cabernet franc'和'Chardonnay'两个品种的微切片中均识别出四种化学上不同的光谱组分。两个品种的堵塞物均呈现出以1604 cm?1处宽而强的拉曼峰和997 cm?1处尖锐峰为特征的光谱。997 cm?1峰对应芪类化合物的芳香环振动模式，而1604 cm?1宽带则代表混合芳香族组分的共同振动，拟合分析确认其主要成分为芪类化合物和黄酮类化合物的混合物。细胞角和导管壁区域显示出木质素的典型特征峰（1603、1667 cm?1）以及芪类标记峰997 cm?1。纤维细胞壁除芳香族峰外还呈现较多的碳水化合物信号（1094、378 cm?1）。在堵塞导管相邻的薄壁细胞腔中，研究人员观察到了淀粉粒的存在，以477 cm?1为标记峰。拉曼分析直接证明了堵塞物为富含酚类化合物的凝胶-树胶状结构，且芪类化合物是其中重要的组成成分。
3.5 越冬葡萄茎木质部薄壁组织中代谢与冷驯化相关基因高表达
对未受伤的越冬茎段木质部薄壁组织转录组分析显示，表达量最高的200个基因显著富集于糖原代谢、冷驯化、纤维素生物合成、核苷酸代谢和非生物胁迫响应等GO生物学过程，以及碳水化合物代谢（特别是淀粉降解）、细胞呼吸和蛋白水解等MapMan功能类别。这些结果证实了越冬木本组织虽然代谢活动整体较慢，但仍维持着与冷驯化和能量代谢相关的活跃转录状态。
3.6 创伤强烈上调次生代谢与细胞壁相关基因的表达
在创伤响应中，共鉴定出917个上调和376个下调的差异表达基因。基因型间的创伤响应差异很小，仅4个基因表现出显著的基因型×处理互作效应，因此在后续分析中两个基因型的响应被合并处理。上调基因显著富集于脂质代谢、角质/木栓质生物合成、次生代谢过程、物质转运和乙烯信号传导等GO术语，以及ERF和WRKY转录因子、蛋白质修饰、细胞壁组织和茉莉酸信号传导等MapMan功能类别。
对相对表达变化最大的30个基因的分析中，研究人员鉴定出转录调控因子MYB39/MYB181（即此前报道的VvMYB107）及其潜在靶基因，包括CYP86A1、多个漆酶基因（LAC17、LAC22、LAC37、LAC35）和脂质转运蛋白基因。此列表还包含创伤响应相关基因，如过氧化物酶（PrxIII12a）、壳三糖苷酶、茉莉酸合成相关基因（丙二烯氧化物合酶）、茉莉酸转运蛋白、Kunitz蛋白酶抑制剂、导向蛋白（dirigent protein, DIR4）以及液泡膜内在蛋白家族的水通道蛋白。
对统计显著性最强的30个基因的分析中，上调最显著的基因包括漆酶家族基因（LAC37、LAC36、LAC30i、LAC28）、三个水通道蛋白、推测的12-氧代植物二烯酸还原酶（12-oxophytodienoate reductase）、两个G型凝集素S受体样丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶（LECRK3）以及三个转录因子，其中ERF113在拟南芥中的直系同源基因已被证明参与创伤诱导的木质素沉积，NAC92（拟南芥ANAC087直系同源基因）调控程序性细胞死亡和叶片衰老，PHR1则具有多种非磷胁迫响应功能。
对绝对转录本丰度增加幅度最大的30个基因的分析中，此列表突出显示了次生代谢相关基因，包括漆酶LAC54、五个芪合酶基因（STS36、STS9、STS5、STS38、STS48）、三个肉桂酸-4-羟化酶（C4H1、C4H2、C4H3）和两个金鱼草素合酶。还包括过氧化物酶、额外的水通道蛋白和WRKY20转录因子。特别值得注意的是，Vitvi06g00771/PRX4（即PrxIII45a）在创伤后36天被强烈上调，该酶在最近的细胞培养研究中已被证实可催化白藜芦醇转化为二聚体和三聚体，提示其可能参与受伤木质组织中芪类化合物的寡聚化过程。
此外，鉴于创伤触发富含果胶的木质部导管堵塞物的形成，研究人员重点分析了与果胶相关的差异表达基因，共鉴定出12个果胶相关基因，包括两个上调的果胶甲酯酶、三个β-半乳糖苷酶、两个β-D-木糖苷酶的上调表达，以及两个果胶甲酯酶、一个果胶酯酶抑制剂、果胶裂解酶和β-半乳糖苷酶的下调，另有果胶酶和多聚半乳糖醛酸酶相关基因的差异表达。
四、研究讨论与结论
研究讨论部分围绕四个核心发现展开。首先，冬季创伤诱导的木质部导管堵塞形成部分受外界温度调控。越冬木本组织代谢缓慢，但冷驯化和碳水化合物代谢基因的富集表明其维持着特定的发育程序。堵塞物基础水平随冬季时间推移逐渐增加，创伤则加速了这一过程，且在10 mm深度处的诱导效应强于2 mm处。累积日平均温度与堵塞增加百分比之间的显著相关支持温度的直接参与，这一温度依赖模式与利用积温模型预测芽萌发具有类似性。然而，季节因素和距伤口深度的影响仍然显著，表明温度是部分调节因子而非唯一决定因素。
其次，创伤触发次生代谢相关基因的上调及多酚的积累。木质部薄壁组织中芪合酶和第八组漆酶基因的大量表达与芪类化合物在受伤组织中的积累高度吻合，且转录组和代谢组数据的一致性在与文献其他实验系统的比较中得到验证。芪类化合物从单体到二聚体、三聚体再到四聚体的逐步寡聚化模式在两个品种中均被观察到，PRX4的创伤上调表达为其在活体组织中的功能提供了转录证据。
第三，创伤触发果胶相关基因的差异表达以及富含果胶的堵塞物形成。拉曼光谱证实堵塞物为凝胶-树胶状结构，富含芪类和黄酮类芳香族化合物的混合物。但由于芳香族成分的高拉曼散射强度，果胶的特征拉曼信号可能被掩盖，使得堵塞物中多糖组分的精确鉴定仍具有挑战性，果胶相关基因变化的方向也缺乏清晰规律，果胶代谢与堵塞物形成之间的分子联系仍需进一步阐明。
第四，创伤上调茉莉酸信号、木栓质和木质素形成的基因调控通路。ERF113作为MYC2下游调控因子的上调表达与拟南芥中JA介导的创伤木质素沉积机制一致。MYB107及其潜在靶基因的协调上调则提示该调控模块可能参与了创伤诱导的木栓质沉积。但MYC2本身在本数据集中未显示差异表达，需要更多研究来明确上述通路在葡萄树中的具体作用。
研究结论指出，本研究通过组织学、代谢组学、转录组学和光谱学的多尺度整合分析，证明了葡萄树冬季修剪创伤响应的实质是防御途径的协调激活、多酚的积累和木质部堵塞物的形成，并首次在田间条件下揭示温度是木质部导管堵塞物形成的重要潜在调控因子。随着气候变化加剧，理解和预测植物防御响应和病原菌侵染性的温度调控将日益重要。未来研究应进一步表征不同类型防御响应的精细动态、其季节变异性以及对温度的敏感性，最终构建可用于指导修剪时机以减轻葡萄树病害的温度依赖型堵塞形成模型，并通过鉴定关键生物标志基因为培育适应气候波动的抗病品种提供靶点。
