《Veterinary Medicine International》：Novel Liposomal Adjuvants Enhance the Immune Response to Recombinant Staphylococcus aureus Antigens in Dairy Heifers
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开发有效的佐剂系统仍是兽医疫苗设计中的关键挑战，尤其对于给奶牛养殖业造成重大经济损失的传染病而言。本研究评估了由重组抗原混合物与含有不同组合的gemini脂肽AG2-C16、牛特异性CpG寡脱氧核苷酸（CpG-ODN）以及酿酒酵母甘露聚糖（Man）的阳离子脂质
开发有效的佐剂系统仍是兽医疫苗设计中的关键挑战，尤其对于给奶牛养殖业造成重大经济损失的传染病而言。本研究评估了由重组抗原混合物与含有不同组合的gemini脂肽AG2-C16、牛特异性CpG寡脱氧核苷酸（CpG-ODN）以及酿酒酵母甘露聚糖（Man）的阳离子脂质体配制的制剂在青年奶牛中所诱导的免疫学特征。将35头8–10月龄的青年奶牛随机分为七组，分别接种由重组金黄色葡萄球菌抗原（α-毒素、β-毒素、凝集因子A和纤连蛋白结合蛋白A）与不同佐剂组合配制的免疫原。动物接受两次初次免疫（间隔21天），并在8个月后给予一次加强免疫。通过ELISA检测特异性免疫球蛋白G（IgG）、IgG1和IgG2水平来评估体液免疫应答，并通过全血试验评估细胞因子产生情况。结果表明，联合AG2-C16、CpG-ODN和甘露聚糖的脂质体制剂能在青年奶牛中诱导显著的免疫应答，并伴有IFN-γ的产生。这些发现为在牛群中开发新型疫苗策略提供了有价值的见解。
论文解读文章
研究背景与目的
奶牛养殖业的扩张加剧了传染病的风险，其中金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）是全球范围内导致牛乳腺内感染（IMIs）的主要病原体之一。该菌引起的乳腺炎具有慢性、传染性及抗菌治疗低治愈率的特点，导致产奶量和质量下降、体细胞数升高及淘汰率增加，给乳品行业带来巨大经济损失。因此，开发新型疫苗并结合能增强疫苗效力的佐剂系统，是减少对抗菌治疗依赖、改善奶牛群乳房健康的重要策略。研究人员此前已在鼠模型中验证了包含新型gemini脂肽AG2-C16和鼠特异性CpG-ODN的脂质体配方能诱导强烈的体液和Th1型细胞免疫应答，但尚未在牛模型中进行评估。本研究旨在首次评估将含有AG2-C16、牛特异性CpG-ODN及酿酒酵母甘露聚糖（Man）不同组合的阳离子脂质体佐剂，与重组金黄色葡萄球菌抗原（rAt、rBt、rClfA、rFnbpA）联合配制后在青年奶牛中诱导的免疫应答特征，为开发针对牛乳腺炎的疫苗策略提供依据。
主要关键技术方法
- 1.
抗原生产与纯化：从实验室先前获得的克隆中扩增编码α-毒素（At）、β-毒素（Bt）、凝集因子A（ClfA）和纤连蛋白结合蛋白A（FnbpA）的基因序列，克隆至不编码融合蛋白的表达载体（pET24a、pET28c、pET-TEV）中，在大肠杆菌BL21（DE3）中诱导表达，并通过镍柱纯化获得重组抗原。
- 2.
脂质体与免疫刺激物制备：采用乙醇注入法制备由二棕榈酰磷脂酰胆碱、胆固醇和硬脂胺组成的阳离子脂质体（Lip）。所用免疫刺激物包括：牛特异性CpG寡脱氧核苷酸（CpG-ODN）、Gemini脂肽AG2-C16以及商业化的酿酒酵母甘露聚糖（Man）。
- 3.
动物免疫与分组：选取来自阿根廷INTA Rafaela实验站奶牛群的35头8–10月龄青年奶牛，随机分为7组（每组n=5）。四个免疫组分别为：G1（Lip+CpG-ODN+Rec）、G2（Lip+AG2-C16+Rec）、G3（Lip+CpG-ODN+AG2-C16+Rec）和G4（Lip+Man+Rec）；三个对照组为：C1（未免疫对照）、C2（Lip+CpG-ODN+AG2-C16，作为G1/G2/G3的载体对照）和C3（Lip+Man，作为G4的载体对照）。动物在第0天和第21天皮下接种两剂初免，8个月后进行一次加强免疫。
- 4.
免疫应答评估：
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体液免疫：通过间接ELISA定期检测血清中针对四种重组抗原的特异性IgG、IgG1和IgG2抗体水平及滴度。
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细胞免疫：在第二次免疫后21天，采集肝素抗凝血进行全血试验（WBA），用重组ClfA和FnbpA刺激后，通过ELISA定量检测上清液中IFN-γ、IL-4、IL-5和IL-17的浓度。
- 5.
统计分析：采用Friedman检验、Wilcoxon检验、Kruskal-Wallis检验及Dunn多重比较校正等方法进行统计学分析。
研究结果
3.1 制剂表征
动态光散射（DLS）测量显示，空脂质体的粒径为201.2 nm。添加CpG-ODN显著增加了粒径和多分散性指数（PDI），而加入AG2-C16则表现出稳定作用，降低了含CpG-ODN制剂的粒径和PDI。添加Man或AG2-C16对粒径影响较小，所有制剂的PDI大多低于0.5，表明颗粒大小较为均匀。
3.2 体液免疫应答
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3.2.1 血清中抗重组抗原IgG：所有免疫组的IgG水平随时间显著升高。与未免疫对照（C1）相比，G1组对所有四种抗原均显示出显著升高的IgG水平。在峰值时间点（初免后第35天），各组均产生了显著的特异性IgG。加强免疫后15天（第276天），抗体水平回升，其中G1和G4组对所有四种抗原均表现出最广泛的应答。
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3.2.2 IgG滴度：第35天和第276天的滴度分析证实，所有免疫组均比对照组产生了更高的抗体滴度。G4组在加强免疫后对所有四种抗原均诱导了显著的抗体滴度。
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3.2.3 血清中抗重组抗原IgG1和IgG2：所有配方均诱导了特异性IgG1和IgG2的产生。在初免后（第35天），G2和G3组对多种抗原诱导了高水平的IgG1和IgG2。加强免疫后（第276天），G4组的应答广度增加，对所有四种抗原均显示出显著的IgG1和IgG2水平。
3.3 细胞因子产生
第二次免疫后21天的全血试验结果显示，所有免疫组在用rFnbpA和rClfA刺激后均产生了IFN-γ。其中，G4组（Lip+Man+Rec）对两种抗原均诱导了显著高于对照组的IFN-γ水平，G3组（Lip+CpG-ODN+AG2-C16+Rec）对rClfA的刺激也表现出显著升高的IFN-γ。此外，仅在G4组中检测到显著的IL-17A产生。所有组均未检测到IL-4或IL-5的产生。这表明，含Man的配方倾向于诱导Th1/Th17混合型应答，而含AG2-C16和CpG-ODN的组合则主要诱导Th1型应答。
讨论总结与研究结论
讨论总结：亚单位疫苗是兽医免疫领域有前景的方法，而有效的佐剂系统是其关键。本研究中，基于脂质体的佐剂既可作为递送系统保护抗原，又可作为免疫激活剂。粒径约200 nm的颗粒有利于抗原呈递细胞的摄取。CpG-ODN的加入会导致脂质体聚集，而AG2-C16因其阳离子特性可起到稳定作用。Man的加入对粒径影响不大。所有配方均能有效诱导针对大部分抗原的特异性抗体，但rFnbpA的抗体反应较弱，这可能与其在不含融合标签时结构不稳定有关。加强免疫后抗体水平回升，表明配方能诱导免疫记忆。在细胞免疫方面，所有配方均促进了Th1型应答（以IFN-γ和IgG2升高为标志），其中G4组还额外诱导了Th17型应答（IL-17升高），这对于清除细胞外细菌如金黄色葡萄球菌可能更有利。尽管本研究存在样本量小、未进行攻毒保护试验等局限性，但其结果为开发新型牛用疫苗佐剂提供了重要依据。
研究结论：综上所述，本研究证明了所选的金黄色葡萄球菌毒力因子与联合AG2-C16、CpG-ODN和甘露聚糖的脂质体配方，能够在青年奶牛中诱导显著的体液免疫应答和偏向Th1型的细胞因子谱。这些发现为在牛群中开发包含新型佐剂的疫苗策略提供了有价值的见解。然而，未来仍需开展进一步研究以优化这些配方，并对进入转化研究的配方进行全面的稳定性测试。
