双氢睾酮通过抑制TGF-β/Smad信号通路促进和田羊真皮乳头细胞增殖

《Veterinary Medicine and Science》：Dihydrotestosterone Promotes Hetian Sheep Dermal Papilla Cell Proliferation by Inhibiting the TGF-β/Smad Signalling Pathway

　　

毛囊作为哺乳动物皮肤中的关键附属器官，其生长发育受到遗传因素、激素及局部微环境的精确调控。本研究探讨了双氢睾酮（dihydrotestosterone，DHT）对新疆和田羊真皮乳头细胞（dermal papilla cells，DPCs）增殖的影响及其与TGF-β/Smad信号通路的调控关系。研究人员采用胶原酶II消化法从新生和田羊背部皮肤组织中分离DPCs，并通过原代培养、传代及α-SMA和CD133双重免疫荧光染色鉴定其特性。利用CCK-8和EdU实验评估不同浓度DHT（0、1、10、100和1000 nM）对DPC增殖的影响。结果表明，随着DHT浓度的升高，细胞增殖能力增强，其中1000 nM浓度下增殖率最高。此外，qPCR分析显示，1000 nM DHT显著上调Smad6基因表达（p < 0.05），同时抑制TGF-β1、TGF-βRII和Smad5的表达（p < 0.05）。这些发现提示，高浓度DHT可能通过抑制TGF-β/Smad信号通路促进DPC增殖，表明该通路在调控毛囊发育和激素依赖性毛发生长中发挥关键作用，为雄激素作用于真皮乳头细胞功能的分子机制提供了证据。

论文解读：双氢睾酮通过抑制TGF-β/Smad信号通路促进和田羊真皮乳头细胞增殖

一、研究背景与科学问题

毛囊是哺乳动物皮肤的重要附属器官，其生长发育受遗传因素、激素和局部微环境的共同调控。毛囊由内根鞘、外根鞘、结缔组织鞘、毛球和真皮乳头等结构组成。真皮乳头位于毛球基部，富含血管和神经，为毛发生长提供营养支持。真皮乳头细胞（dermal papilla cells，DPCs）作为毛囊发育和周期性生长的信号调控中枢，通过旁分泌机制释放多种信号分子，引导周围毛囊基质细胞的增殖和向上迁移，进而分化为毛球、内根鞘和外根鞘等结构。DPCs还通过分泌多种生长因子（如VEGF、FGF和Wnt）与上皮细胞相互作用，维持毛囊干细胞活性并驱动毛发生长。研究表明，DPCs功能异常与脱发和毛囊萎缩等病理过程密切相关，因此阐明DPCs增殖的调控机制对于研究毛囊发育和制定毛发再生治疗策略至关重要。

激素对毛发生长和毛囊发育具有重要影响。雄激素在毛发生长调控中发挥关键作用。双氢睾酮（dihydrotestosterone，DHT）作为一种强效雄激素，对毛发生长具有双重效应：一方面促进体毛（如胡须和腋毛）的生长，另一方面其过度累积可导致雄激素性脱发。现有研究表明，DHT可能通过调控Wnt/β-catenin和TGF-β/Smad等信号通路改变DPCs的增殖与凋亡平衡，但具体机制尚不完全清楚。

转化生长因子-β（transforming growth factor-β，TGF-β）是一种多功能生长因子和促纤维化细胞因子，可诱导成纤维细胞增殖和转化。TGF-β超家族包含30多种配体，属于TGF-β、骨形态发生蛋白、激活素、抑制素、生长分化因子和结节点等亚家族。在经典TGF-β信号通路中，TGF-β配体与特异性丝氨酸/苏氨酸激酶受体（I型和II型）结合，激活受体调控型Smad蛋白。Smad蛋白分为三类：受体调控型Smad（如Smad2和Smad3）、通用型Smad（如Smad4）和抑制型Smad（如Smad7）。研究表明TGF-β信号通路调控表皮稳态、毛囊周期进程以及毛囊上皮干细胞群的增殖和分化。其中Smad1和Smad5是独特的TGF-β通路介质，调控毛囊发育、周期性生长和色素沉积。已知雄激素可促进人DPCs中TGF-β1的表达，但雄激素是否调控绵羊DPCs中TGF-β/Smad信号通路的基因表达仍需进一步研究。

和田羊是新疆和田地区的本土品种，以优质羊毛和对极端环境的强适应性著称。与兔、小鼠等常规动物细胞模型相比，新生和田羔羊来源的原代细胞具有显著更高的活力和增殖能力。新生羔羊被选为最佳供体模型的原因包括：其DPCs具有优越的活力和增殖潜力，有利于建立稳健的原代培养体系；其内源性雄激素水平低，可最大限度减少激素干扰，从而更精确地评估外源性DHT的直接效应；统一的新生年龄段保证了样本间的生物学一致性和实验可重复性。值得注意的是，绵羊皮肤在结构、厚度、毛囊密度和周期性生长模式等方面与人类皮肤相似，尤其在伤口愈合和瘢痕形成过程中，这凸显了和田羊细胞模型作为人类皮肤病学和毛发疾病生物医学研究工具的相关性。

二、研究内容与结论

本研究以和田羊为模型，分离培养DPCs，应用细胞和分子生物学技术评估DHT对细胞增殖的剂量依赖性效应，并分析TGF-β家族成员和Smad信号相关基因表达的变化。研究结果表明，DHT以浓度依赖性方式促进DPC增殖，1000 nM浓度下增殖能力最强。基因表达分析显示，1000 nM DHT显著下调TGF-β1和TGF-βRII的表达，上调Smad6的表达，抑制Smad5的表达。这些发现提示高浓度DHT可能通过抑制TGF-β/Smad信号通路促进DPC增殖，为阐明羊毛纤维品质形成的生物学基础提供了直接证据，也为人类毛发疾病（如雄激素性脱发）的研究提供了新见解和潜在治疗靶点。

三、主要技术方法

研究人员采用胶原酶II消化法从新生和田羊背部皮肤组织中分离DPCs，通过显微解剖获取毛乳头并进行原代培养。细胞鉴定采用α-SMA和CD133双重免疫荧光染色。细胞增殖评估使用CCK-8和EdU流式细胞术。基因表达分析采用实时荧光定量PCR（qPCR）检测TGF-β1、TGF-β2、TGF-β3、TGF-βRII、Smad1、Smad2、Smad3、Smad4、Smad5、Smad6和Smad7共11个基因的mRNA表达水平，以GAPDH为内参，采用2^–ΔΔCt相对定量法计算。所有体外实验均来源于单一生物学供体（n = 1）的DPCs，文中"重复"均指技术重复。细胞形态学观察采用H&E染色、Giemsa染色和染色体核型分析。

四、研究结果

4.1 DPCs原代培养与形态变化

在悬浮培养过程中，第1天多数DPCs牢固贴壁；第3天细胞开始迁移，主要呈成纤维细胞样形态，部分细胞呈梭形或三角形；第5天细胞逐渐增大并呈长梭形，从边缘向外周放射状生长；第7天细胞进入对数生长期并呈现聚集趋势；第12天细胞融合度达70–80%，形态均匀，适合首次传代。

4.2 DPCs细胞学与核型分析

第三代DPCs的H&E染色显示细胞整体呈紫红色，核仁丰富；Giemsa染色显示细胞质呈淡蓝色，胞体中央有1–2个紫红色核仁。染色体计数分析显示每个细胞核含54条染色体，包括26对常染色体和1对性染色体，与绵羊核型一致，证实所分离的DPCs确为绵羊来源。

4.3 DPCs免疫荧光鉴定

双重免疫荧光染色结果显示，和田羊DPCs中CD133和α-SMA均呈阳性表达，合并图像显示两种抗体共标记细胞。CD133和α-SMA特异性标志物的共表达证实所培养细胞为DPCs。

4.4 传代DPCs生长特性

第三代传代DPCs在培养前1–2天处于潜伏期，生长缓慢；第3天开始快速增殖进入对数生长期；第5–6天达到平台期；第7天达到生长高峰，随后细胞逐渐衰老死亡。结果表明和田羊毛DPCs具有较强的生长和分裂能力。

4.5 DHT浓度对DPC增殖的影响

CCK-8检测结果显示，不同浓度DHT处理48 h后DPC活力无显著差异（one-way ANOVA，p > 0.05）。但EdU流式细胞术分析显示，随着DHT浓度升高，细胞增殖能力逐渐增强，1000 nM DHT时达到峰值。统计分析显示DHT浓度对EdU掺入有显著整体效应（p < 0.05），事后比较显示1000 nM组与对照组间差异显著（p < 0.05）。

4.6 DHT处理对DPC基因表达的影响

与对照组相比，1000 nM DHT组TGF-β1和TGF-βRII的表达显著下调（Student's t检验，p < 0.01）；TGF-β2和TGF-β3的表达无显著差异。在SMAD基因家族中，1000 nM DHT处理降低了Smad2和Smad6的表达，增加了Smad5的表达，对Smad1、Smad3、Smad4和Smad7的表达无显著影响。

五、讨论与结论

讨论部分总结： 研究人员成功建立了和田羊DPCs体外培养体系，证实了CD133和α-SMA双阳性标记可确认细胞身份。研究发现DHT以浓度依赖性方式促进DPC增殖，同时抑制TGF-β1和TGF-βRII的表达。雄激素可能通过下调DPCs中TGF-β1表达来抑制毛囊生长和发育。此外，雄激素刺激增加了Smad5表达并降低了Smad6表达，提示雄激素可能通过调控Smad5和Smad6水平间接影响BMP信号通路，进而调节毛囊周期和发育。研究存在一定局限性：尚未在蛋白质水平进行Western blot等补充验证实验；关于DHT对TGF-β/Smad通路抑制作用的结论仅基于基因表达数据；未来应通过外源性TGF-β1补充或Smad信号药理学抑制等拯救实验提供更强的功能证据，并通过动物模型或3D培养系统验证体内相关性。

结论翻译： 研究人员从和田羊中分离出DPCs并建立了可靠的培养体系。研究发现雄激素通过抑制TGF-β/Smad通路基因的表达促进DPC增殖，从而影响毛囊发育。该研究建立了绵羊雄激素调控与毛囊发育联系的体外模型，为提高绵羊毛产量提供了理论基础，并为研究雄激素性脱发提供了新的研究方向。