实验性感染生物膜阳性与阴性金黄色葡萄球菌菌株后山羊奶中微量元素的变化

《Veterinary Medicine and Science》：Trace Element Changes in Goat Milk Following Experimentally Induced Intramammary Infection With Biofilm Positive and Negative Strains of Staphylococcus aureus

　　

背景：奶中微量元素可提供有关乳腺健康和免疫反应的有价值信息。金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）的生物膜形成能力已知与持续性和慢性乳腺炎感染相关。

目的：本研究旨在比较山羊实验性乳腺内感染生物膜阳性和阴性金黄色葡萄球菌菌株后奶中微量元素浓度的变化。

方法：研究人员将9只健康泌乳山羊（伊朗本地品种，1–5岁）分为两组，分别经乳池内接种生物膜阳性菌株（n=5）或生物膜阴性菌株（n=4）的金黄色葡萄球菌（10³ CFU/mL）。菌株分离自牛乳腺炎病例，并通过聚合酶链反应（PCR）扩增nuc基因进行确认。感染确认后使用头孢噻呋（Ceftiofur）进行治疗；选择头孢噻呋是因为两种菌株均对此抗生素敏感，且既往研究表明头孢噻呋对生物膜阳性和阴性金黄色葡萄球菌分离株均有效。在攻毒前（T0）、攻毒后6（T1）、12（T2）、24（T3）、36（T4）、48（T5）和72（T6）小时、治疗前（T7）以及治疗后1（T8）、7（T9）和14（T10）天采集奶样。采用电感耦合等离子体发射光谱法（ICP-OES）测定铜、钙、硒、锌、镁、钾、钠和磷的浓度。

结果：在T2和T4时间点，生物膜阳性组奶钙浓度显著高于生物膜阴性组（p<0.05）。在T4和T10时间点，生物膜阳性组奶硒含量显著高于生物膜阴性组（p<0.05）。在T7时间点，生物膜阳性组奶钾和磷水平显著高于生物膜阴性组（p<0.05）。

结论：与生物膜阴性菌株相比，生物膜阳性金黄色葡萄球菌菌株诱导更多特定微量元素（尤其是钙、硒、钾和磷）分泌至山羊奶中。这些发现与生物膜形成菌株引起更广泛的乳腺上皮损伤和屏障功能障碍的假说一致。这些改变可能提示乳腺上皮通透性增加，也可能导致局部免疫受损，从而使生物膜阳性菌株引起的乳腺炎持续存在。

乳腺炎（mastitis）是奶用动物最常见且经济影响最严重的疾病之一，通过降低产奶量和乳品质、缩短生产寿命、增加劳动力成本并损害动物福利造成重大损失。乳腺组织损伤由细胞凋亡或坏死介导，减少乳腺上皮细胞的数量和活性，进而导致产奶量下降。金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）是革兰氏阳性人畜共患病原菌，也是山羊和小型反刍动物亚临床乳腺炎的主要病原，在山羊中占60%–80.7%。生物膜（biofilm）形成是金黄色葡萄球菌的重要毒力因子，可赋予细菌对抗生素和消毒剂的高水平耐药性，降低巨噬细胞吞噬敏感性，并帮助细菌逃避宿主免疫应答，从而常导致持续性和慢性感染。既往研究还发现，分离自牛乳腺炎的生物膜阳性金黄色葡萄球菌对青霉素、林可霉素、苯唑西林、甲氧西林和万古霉素的耐药率显著高于生物膜阴性菌株。微量元素（trace elements）在免疫功能和抗氧化防御中发挥关键作用；乳腺炎期间，乳腺组织损伤和血乳屏障通透性增加会改变微量元素向奶中的转移，因此奶中微量元素谱可为评估乳腺健康和免疫状态提供参考。以往大多数有关生物膜的研究集中于牛乳腺炎分离菌株，关于山羊乳腺炎的研究有限，且尚无研究探讨山羊实验性金黄色葡萄球菌感染后奶中微量元素的变化，也未比较生物膜形成能力对微量元素稳态的影响。因此，研究人员开展本研究，假设生物膜阳性菌株较生物膜阴性菌株引起更大程度的微量元素稳态破坏，反映更严重的乳腺上皮损伤和屏障功能障碍，其机制可能与其增强的毒力和抗生素耐药特性有关。

研究人员使用此前分离自慢性牛乳腺炎病例的金黄色葡萄球菌菌株，经聚合酶链反应（PCR）扩增nuc基因确认。采用微量滴定板法评估生物膜形成能力，根据570 nm处光密度值将菌株分为非生物膜形成、弱、中或强类别，并选取一株强生物膜阳性菌株和一株生物膜阴性菌株进行实验；两菌株经纸片扩散法药敏试验均对头孢噻呋（Ceftiofur）敏感，头孢噻呋因乳腺组织穿透性好、为第三代头孢菌素且既往研究证实对两类菌株有效而被选为治疗药物。9只健康泌乳山羊（伊朗本地品种，平均体重32±6.2 kg，1–5岁，泌乳早中期）纳入研究，经临床检查和两次奶细菌学培养阴性确认无先前感染后，于一侧乳池内接种10³ CFU/mL的生物膜阳性（n=5）或生物膜阴性（n=4）菌株；生物膜阴性组一只山羊因发生伴全身症状的严重急性乳腺炎，出于伦理方案被排除，导致两组样本量不均衡。在T0（攻毒前）、T1（6小时）、T2（12小时）、T3（24小时）、T4（36小时）、T5（48小时）、T6（72小时）、T7（治疗前）、T8（治疗后1天）、T9（治疗后7天）和T10（治疗后14天）采集奶样，使用电感耦合等离子体发射光谱法（ICP-OES）测定铜、钙、硒、锌、镁、钾、钠和磷浓度。统计学分析采用独立样本t检验比较两组各时间点差异，Friedman检验分析组内趋势，Wilcoxon检验比较各时间点与基线差异，并采用Bonferroni校正。

3.1 临床观察
攻毒后，生物膜阳性组山羊相较于生物膜阴性组出现更明显的临床症状。所有山羊均在攻毒后24–48小时内出现乳房肿胀和发热，但生物膜阳性组炎症更严重，5只中山羊有3只出现可检测的全身症状（轻度发热、食欲下降），而生物膜阴性组4只中仅有1只。头孢噻呋治疗后3–5天内两组临床症状均消退，治疗后第7天奶培养转为阴性，所有动物均完全康复，无长期后遗症。

3.2 微量元素分析
Friedman检验用于评估接种后各组内随时间的变化，结果显示除钠外，时间对大多数微量元素无显著影响（p>0.05）；钠随时间呈显著变化，且时间与分组之间存在显著交互作用（p<0.05）。治疗前后比较显示，钙水平随时间显著变化（p<0.05）。组间比较发现：生物膜阴性组在T1（接种后6小时）的奶钠和镁浓度显著高于生物膜阳性组（p<0.05），但此后因生物膜阳性组奶钠和镁浓度逐渐升高，两组间差异消失。奶钙浓度在T2（接种后12小时）和T4（接种后36小时）时生物膜阳性组显著高于生物膜阴性组（p<0.05）。奶硒含量在T4（接种后36小时）和T10（治疗后14天）时生物膜阳性组显著高于生物膜阴性组（p<0.05）。奶钾和磷水平在T7（治疗前）时生物膜阳性组显著高于生物膜阴性组（p<0.05）。锌和铜浓度在各时间点两组间均无显著差异。

讨论部分指出，本研究中生物膜阳性组更严重的临床表现与生物膜形成菌株已知的毒力特征一致，生物膜形成增强细菌对宿主免疫防御和抗菌治疗的抵抗，并因炎症反应导致更大组织损伤。硒是受损组织中的重要抗氧化剂；本研究中生物膜阳性组奶硒显著升高，可能降低硒向宿主免疫系统的可用性，但该推测需通过血液、乳腺组织和免疫细胞中硒水平的测定加以验证。奶钙升高与紧密连接破坏及多形核中性粒细胞向感染乳腺浸润一致，提示生物膜阳性菌株引起更大的乳腺上皮通透性和屏障功能障碍。治疗前钾和磷显著升高与导管分泌细胞和上皮退化一致。钠和镁在T1时生物膜阴性组较高，但随后阳性组逐渐升高，提示生物膜阳性菌株最终引起更大钠镁释放入奶。锌和铜未观察到组间差异。治疗选择方面，药敏试验显示两菌株均对头孢噻呋敏感，且既往研究显示头孢噻呋对生物膜阳性和阴性分离株均有效，验证了治疗选择的合理性。研究人员指出研究局限性包括样本量小且不均衡、未对多重比较进行校正、缺乏血液微量元素测量以及使用牛源金黄色葡萄球菌菌株，结果应视为探索性和假设生成性的，需在更大规模研究中验证。

综上所述，与生物膜阴性菌株相比，生物膜阳性金黄色葡萄球菌菌株的乳腺内感染诱导更多关键微量元素（尤其是硒、钙、钾和磷）分泌至山羊奶中。这些结果支持生物膜阳性菌株由于其生物膜形成能力以及可能更高的整体毒力和抗生素耐药机制，导致乳腺上皮细胞更严重损伤和上皮屏障功能破坏的观点。这些改变可能反映乳腺上皮通透性增加，并可能通过减少局部必需元素的可利用性损害宿主免疫防御，从而促成生物膜形成菌株所致乳腺炎的慢性和持续性特征。生物膜阳性组更严重的临床症状和更大的微量元素改变支持这一解释。这一机制仍有待未来研究通过检测血液微量元素浓度、氧化应激标志物和乳腺通透性标志物直接验证。本研究的应用意义在于，奶微量元素谱可作为一种非侵入性工具，用于指导乳山羊养殖中生物膜相关乳腺炎的诊断和靶向治疗决策；生物膜阳性菌株表现出的不同抗生素敏感性和更显著的微量元素变化，凸显了乳腺炎靶向治疗的重要性。