《Nano Select》：Molecular Mechanisms and Therapeutic Applications of Extracellular Vesicles in Remodeling of the Skin Cancer Niche
皮肤癌（Skin cancer），涵盖黑色素瘤（melanoma）与非黑色素瘤类型，由于其日益增加的患病率、侵袭性与扩散能力，已成为不断升级的全球健康问题。细胞外囊泡（Extracellular Vesicles, EVs）已成为肿瘤微环境（Tumor Microenvironment, TME）中细胞间通讯的关键介质。这些纳米至微米级的膜结合囊泡由肿瘤细胞、基质细胞和免疫细胞释放，转运蛋白质、脂质和核酸等生物活性物质，从而影响受体细胞的行为。EVs通过内体分选或质膜出芽产生，形成具有独特分子特征的外泌体（exosomes）和微囊泡（microvesicles）。在皮肤癌中，EVs所携带的货物反映了起源细胞的遗传与代谢状态，含有丰富的整合素（integrins）、基质金属蛋白酶（matrix metalloproteinases）、生长因子及调节性microRNAs，这些物质调节增殖、存活和应激反应。肿瘤来源的EVs通过递送免疫检查点分子如程序性死亡配体1（programmed death-ligand 1, PD-L1）来促进免疫逃逸，从而抑制细胞毒性T细胞活性并促进调节性T细胞扩增。它们还促进血管生成，并将成纤维细胞转化为肿瘤相关成纤维细胞（cancer-associated fibroblasts, CAFs），进而协助细胞外基质重塑与侵袭。此外，EVs通过创建转移前生态位（pre-metastatic niches）和增强血管通透性来促进转移。EVs是破坏肿瘤支持性通讯网络的诊断与治疗策略中的有前景靶点。
1 引言
皮肤作为多功能屏障器官，其功能受损可导致DNA修复障碍、慢性炎症及细胞增殖失控，进而促进黑色素瘤和非黑色素瘤皮肤癌的发生。黑色素瘤在全球造成大量死亡，非黑色素瘤皮肤癌新发病例众多，且传统治疗手段（手术、化疗、放疗）常因毒性和耐药性受限。细胞外囊泡（EVs）作为肿瘤微环境（TME）通讯的重要介质，可通过转运肿瘤来源的DNA、蛋白质及非编码RNA，为皮肤癌的早期检测、预后判断及治疗监测提供非侵入性液体活检手段，并成为下一代治疗平台的候选载体。本综述旨在整合EV生物发生、货物组成与TME重塑之间的联系，涵盖免疫逃逸、血管生成、细胞外基质重组、转移生态位形成及治疗耐药，并评估其临床转化前景。
2 EVs概述
EVs是几乎所有细胞分泌的脂质双层纳米囊泡，携带蛋白质、脂质、DNA和多种RNA，介导细胞间通讯。在黑色素瘤中，EVs调节肿瘤与成纤维细胞、内皮细胞和免疫细胞的相互作用；在基底细胞癌（BCC）和皮肤鳞状细胞癌（cSCC）中，EVs参与肿瘤-间质相互作用、炎症和血管生成。根据生物发生方式，EVs分为外泌体（50–200 nm）、微囊泡（50–1000 nm）和凋亡小体（500–4000 nm），其中外泌体研究最为深入。EVs可通过转运致癌蛋白、免疫调节分子和非编码RNA重塑TME，促进血管生成、代谢重编程和免疫抑制，并可作为诊断和治疗平台。
3 皮肤癌中EVs的生物发生与释放机制
EVs在皮肤癌细胞中的产生受精密调控，主要通过内体途径（形成外泌体）和质膜直接出芽（形成微囊泡）完成。内体分选复合物（ESCRT）、四旋蛋白（tetraspanins）、Rab GTPases及脂质代谢的失调可增强EV释放并改变货物组成。低氧、紫外线及治疗应激进一步促进EV分泌。不同尺寸的EV亚群具有独特功能：小EVs（30–150 nm）参与长距离信号和免疫逃逸；中间EVs（100–1000 nm）增强局部肿瘤-间质相互作用；大EVs（1–10 μm）作为微尺度信号细胞器促进侵袭；凋亡小体（500 nm–5 μm）在免疫耐受和抗肿瘤免疫中发挥双重作用。
3.1 外泌体
外泌体生成依赖ESCRT依赖和非依赖途径。中性鞘磷脂酶2（nSMase2）产生的神经酰胺促进内体膜内出芽形成腔内囊泡（ILVs），ESCRT复合物及辅助蛋白（ALIX、VPS4）参与货物分选。四旋蛋白（CD9、CD63、CD81）也在外泌体形成和货物选择中发挥关键作用。
3.2 微囊泡
微囊泡（MVs）源自质膜，通过外向出芽和断裂产生，受细胞内Ca
2+浓度和ARF6信号调控。ARF6过表达可增强MVs释放，但不影响外泌体分泌。MVs选择性富集β1整合素和VAMP3等蛋白，而与外泌体相关的转铁蛋白受体通常缺失。
3.3 凋亡小体
凋亡小体通过caspase-3介导的ROCK1激活等机制形成，涉及MLCK、LIMK1和PAK2对细胞骨架重排的调控，确保程序性细胞死亡过程中细胞内容物的有效包装和清除。
3.4 EVs被受体细胞摄取
EVs通过表面配体-受体相互作用、膜融合或内吞方式进入受体细胞。内吞途径包括网格蛋白介导、小窝蛋白介导和脂筏介导的内吞。小窝蛋白-1（CAV1）在黑色素瘤来源EVs中富集，其磷酸化状态可影响αvβ3整合素传递并促进肺转移；酸性TME可增强外泌体与黑色素瘤细胞的膜融合。网格蛋白介导的内吞（CME）在鳞状细胞癌中参与膜蛋白内化，并在黑色素瘤中调节PD-L1内吞和EV货物传递。脂筏中的清道夫受体B类1型（SR-B1）介导黑色素瘤EV内吞，而SCC来源EVs可通过脂筏相关分子激活成纤维细胞中的AKT和ERK1/2信号。
4 EVs在皮肤癌进展中的作用
EVs通过转运生物活性分子调节肿瘤细胞增殖、侵袭、免疫逃逸、血管生成和治疗耐药。肿瘤来源EVs可传递MYC、BRAF等突变蛋白及抑制PTEN的miRNAs，促进失控性增殖；还可递送PD-L1和细胞因子抑制T细胞活化。EVs促进上皮-间质转化（EMT）、代谢重编程和成纤维细胞向CAFs转化，并增强侵袭和转移潜力。
4.1 肿瘤生长与增殖
高侵袭性黑色素瘤细胞释放富含miR-1246的EVs，通过抑制CCNG2增强低侵袭性细胞亚群的侵袭和转移。含有miR-146a-5p的EVs通过阻断NUMB重编程星形胶质细胞，促进脑转移。EVs携带整合素和基质金属蛋白酶（MMPs）促进预转移生态位形成。此外，血小板来源EVs可促进黑色素瘤迁移和增殖。
4.2 EV介导的信号通路
EVs通过转运蛋白质和miRNAs调节多条关键致癌通路。MAPK/ERK通路中，EVs传递突变BRAF
V600E蛋白和miR-221/222等，导致ERK持续激活并促进耐药。PI3K/AKT/mTOR通路中，EV相关miR-21、miR-155等抑制PTEN，维持通路活化。Wnt/β-catenin通路通过转运Wnt配体和β-catenin促进增殖和干性。Notch信号被EV递送的配体和miRNAs激活，促进血管生成和转移。TGF-β信号在晚期黑色素瘤中通过SMAD依赖途径促进EMT和M2巨噬细胞极化。NF-κB通路被EV携带的细胞因子和热休克蛋白激活，增强炎症和血管生成。JAK/STAT通路中，EV来源的IL-6、miR-155等促进CAF形成和免疫抑制。Hippo/YAP通路被EV相关miR-21和MALAT1抑制LATS1/2，导致YAP活化。整合素-FAK通路中，EV富集的αvβ3等整合素激活FAK信号，促进侵袭。p53通路则因EV传递MDM2而失活，导致凋亡抵抗和基因组不稳定。
4.3 对细胞周期和凋亡的影响
脐带血干细胞来源外泌体通过let-7家族miRNAs抑制黑色素瘤细胞增殖并诱导凋亡，而对正常淋巴细胞影响轻微。黑色素瘤来源外泌体中的let-7a、miR-31等与转移相关，miR-222增强恶性程度。NK细胞来源EVs通过穿孔素和FasL诱导黑色素瘤凋亡。UVA照射的黑色素细胞释放富含miR-21的EVs，可被角质形成细胞摄取，促进增殖并减少凋亡。
4.4 血管生成与血管形成
EVs通过转运促血管生成因子、基质重塑酶和调节性RNA，激活内皮细胞PI3K/AKT、MAPK/ERK等信号，促进内皮增殖、迁移和血管通透性增加。肿瘤来源EVs还可招募内皮祖细胞和骨髓来源细胞。黑色素瘤sEVs通过MET水平转移和uPAR刺激促进血管生成和预转移生态位形成。内皮细胞迁移涉及趋化、趋触和机械趋化三种机制。
4.4.1 促进血管形成
黑色素瘤sEVs通过水平转移MET癌蛋白使骨髓来源细胞向促血管表型分化，并通过uPAR激活内皮细胞EGFR和ERK1/2信号促进血管生成。
4.4.2 与内皮细胞的相互作用
趋化性内皮细胞向TME中的促血管生成信号迁移，VEGF、血管生成素和bFGF等调控这一过程。VEGFR-2是内皮趋化和出芽的关键调控因子，EVs通过递送VEGF或增加受体敏感性增强VEGFR-2磷酸化，激活下游通路。Rho家族小GTPases（Cdc42、Rac1、RhoA）调节肌动蛋白细胞骨架和细胞运动。一氧化氮（NO）由eNOS产生，是VEGFR-2下游的重要信使，调控血管舒张和内皮迁移。其他活性氧（ROS）通过氧化还原信号参与VEGF诱导的VEGFR-2自磷酸化。
4.5 转移与侵袭
EVs通过调控ECM重塑、EMT、免疫逃逸和血管生成促进皮肤癌转移。黑色素瘤EVs携带MMP-2/9和整合素αvβ5/αvβ6，增加血管通透性。Wnt5a在EVs中促进EMT和转移。鳞状细胞癌来源EVs高表达PD-L1和免疫抑制细胞因子，导致T细胞耗竭。耐药黑色素瘤细胞分泌含miR-221/222的EVs，抑制PTEN和TIMP3，促进EMT和耐药。
4.5.1 促进肿瘤细胞迁移
EVs通过递送MMPs、整合素和纤连蛋白降解ECM，并激活MAPK/ERK和PI3K/Akt通路增强运动性。富含miR-1246的EVs可水平传递侵袭性，抑制CCNG2。在BRAF抑制剂存在下，EVs仍能通过旁路信号促进迁移。
4.5.2 调节细胞外基质和免疫细胞
肿瘤EVs携带赖氨酰氧化酶（LOX）改变ECM刚度，整合素引导转移归巢，纤连蛋白和层粘连蛋白促进黏附。EVs还转运免疫抑制分子如PD-L1，抑制T细胞活化，促进免疫抑制性巨噬细胞极化。靶向EV生物发生抑制剂（如GW4869）在临床前模型中显示出潜力。
5 EVs的诊断和预后潜力
EVs作为非侵入性液体活检工具，其货物反映亲本细胞状态。在皮肤癌中，EVs可用于早期检测、疾病进展评估和治疗反应预测。血液、唾液、尿液中的EVs包含miRNAs、蛋白质、脂质和DNA突变。例如，血清EVs中升高的miR-21、miR-155等与黑色素瘤进展相关。PD-L1阳性EVs在黑色素瘤患者血浆中升高，可用于监测免疫治疗反应。
5.1 早期检测生物标志物
EV来源的生物标志物包括miRNAs（如miR-125b、miR-182）、蛋白质（PD-L1、IMP3）和脂质（磷脂酰丝氨酸、鞘磷脂）。特定miRNA组合和蛋白质面板显示出高灵敏度和特异性。例如，miR-532-5p和miR-106b组合AUC达0.936，区分黑色素瘤患者的敏感度92%，特异性88%。
5.1.1 基于EV检测的敏感性和特异性
基于EV的检测平台如数字外泌体囊泡测定法（DEVA）可显著增强PD-L1阳性EVs的检测灵敏度。S100b和MIA等血清标志物敏感度较低，但特异性较高。总体而言，EV-based assays提供非侵入性实时监测，并能预测靶向治疗耐药。
5.2 预后价值
高水平的肿瘤来源EVs与不良预后、侵袭性疾病和低生存率相关。致癌性miRNAs（miR-21、miR-155）指示不良预后，而抗肿瘤miRNAs（miR-34a、miR-200c）与良好结局相关。EV相关PD-L1、HSP70和TGF-β指示免疫抑制和疾病进展。
5.2.1 疾病分期与患者结局的相关性
早期黑色素瘤中，EVs促进肿瘤生长和血管生成；晚期阶段，EVs通过EMT和免疫抑制促进转移。循环中CD63和CD9阳性EVs高水平与晚期和不良预后相关。携带突变BRAF
V600E和PTEN的EVs与靶向治疗耐药相关。
5.2.2 治疗反应的预测标志物
BRAF/MEK抑制剂和免疫检查点抑制剂治疗反应预测依赖生物标志物。EV衍生PD-L1是抗PD-1疗效的非侵入性标志物。高肿瘤突变负荷（TMB）和CD8+ T细胞浸润与较好的免疫治疗反应相关。miR-34a和miR-146a高水平预示免疫治疗阳性反应，而miR-155和miR-222与耐药相关。
6 EVs作为免疫治疗和免疫调节中的细胞信使
免疫治疗对黑色素瘤有效，EVs在免疫调节中发挥双重作用。树突状细胞（DCs）和NK细胞来源EVs可增强抗肿瘤免疫，而肿瘤来源EVs抑制DC成熟、T细胞活化并促进免疫抑制微环境。EVs可作为siRNA、细胞因子和免疫检查点抑制剂的载体。
6.1 调节免疫反应
肿瘤来源EVs通过诱导Treg、M2巨噬细胞和缺陷性CTL实现免疫逃逸。黑色素瘤EVs可改变造血，促进髓源抑制细胞（MDSCs）扩增和脾肿大。治疗性EVs可携带免疫调节物质，促进M1巨噬细胞极化和T细胞效应功能恢复。
6.2 抗原呈递
EVs携带MHC-I/II和共刺激分子参与抗原呈递。DCs来源EVs增强CTL激活，而黑色素瘤EVs常呈免疫抑制效应，如通过淋巴内皮细胞交叉呈递导致CD8+ T细胞缺失。
6.3 肿瘤来源EVs对DCs的调节
黑色素瘤EVs可降低DC成熟标志物CD83/CD86表达，减少Th1极化细胞因子和迁移趋化因子，从而抑制抗原呈递能力。但部分研究表明EVs可携带肿瘤抗原被DCs内化并交叉呈递给CD8+ T细胞，增强免疫应答。效应呈高度依赖EV货物和疾病状态。
6.4 肿瘤来源EVs对CD4+和CD8+ T细胞的调节
黑色素瘤EVs通过递送TIM-3和miR-690诱导CD4+ T细胞线粒体凋亡，并通过PD-L1上调抑制CD8+ T细胞活化、增殖和浸润。高循环PD-L1+ EVs与无进展生存期和总生存期降低相关。EVs也可通过携带肿瘤抗原增强T细胞应答，但多数研究支持其免疫抑制作用。
6.5 肿瘤来源EVs对巨噬细胞的调节
黑色素瘤EVs通过miR-125b-5p和miR-135a-5p促进巨噬细胞M2极化，增强肿瘤支持功能、侵袭和转移。EV相关PD-L1参与免疫检查点阻断耐药。
6.6 肿瘤来源EVs对B细胞的调节
肿瘤EVs促进调节性B细胞（Bregs）发育并抑制CTL反应。某些EV相关miR-99a-5p可促进B细胞成熟和类别转换重组，增强抗肿瘤免疫。EV-B细胞相互作用在黑色素瘤中的作用仍在早期研究阶段。
7 EVs作为治疗平台
EVs因其稳定性、生物相容性和低免疫原性，成为药物递送和靶向治疗的理想平台。表面工程和基因修饰可增强EVs的肿瘤靶向性。
7.1 表面工程EVs用于靶向治疗
通过遗传工程、化学偶联和脂质插入修饰EVs表面。例如，融合蛋白SAV-LA将生物素化CpG DNA偶联至外泌体表面，增强DCs的抗原呈递和抗肿瘤效果。环状RGD肽修饰的ASL-外泌体（dAEx）靶向αvβ3整合素，显著增加肿瘤积累和凋亡。脂质-外泌体杂合纳米颗粒（ELNs）递送siCD44和siCD47，增强基因沉默和抗增殖作用。
7.2 EVs作为药物递送载体
EVs可递送小分子药物、核酸和蛋白质。PEG化EVs包载阿霉素（DOX）显示出比脂质体更高的肿瘤积累和抗增殖活性。靶向PD-L1的抗体工程EVs递送DOX显著抑制黑色素瘤生长。TRAIL功能化的外泌体负载雷公藤甲素（TPL）协同诱导DR5依赖性凋亡，并克服耐药。抗CD20适配体修饰的外泌体有效靶向癌症干细胞。MSC来源EVs负载铜/锡纳米复合材料选择性杀伤A431细胞。牛乳来源EVs负载双氢青蒿素（DHA）增强抗黑色素瘤活性。树突状细胞来源外泌体递送BRAF siRNA显著抑制肿瘤生长。miR-195-5p负载EVs可恢复MAPK通路抑制剂的敏感性。
8 EV疗法的临床转化
EV药物需满足严格的质量控制和安全评估，日本PMDA和美国FDA已制定相应指南。早期临床试验正在评估MSC-EVs递送化疗药物或siRNA的安全性，以及载有免疫调节剂的EVs。工程化EVs结合CRISPR/Cas基因编辑在临床前模型中显示出潜力。规模化制造如生物反应器和3D打印培养系统有助于解决批次一致性。
9 挑战与未来方向
EV分离方法（超速离心、尺寸排阻色谱、免疫亲和捕获、微流体）在产量和纯度上各有优缺点。表征标准化不足（MISEV指南依从性不一致）阻碍结果比较。批次间变异性、缺乏参考物质和体内研究有限是主要挑战。研究偏向黑色素瘤，对BCC和cSCC的EVs了解较少。未来需要自动化可扩展分离平台、合成EV模拟物和标准化表征技术，以及实时释放测试和效力评估。
10 结论
EVs是皮肤癌微环境中至关重要的细胞间通讯介质，通过递送蛋白质、脂质和核酸调控肿瘤生长、免疫逃逸、血管生成和转移。EVs作为非侵入性生物标志物和治疗载体具有广阔前景，但标准化和临床转化仍需克服诸多障碍。未来研究应聚焦EV异质性、体内示踪和个性化治疗策略，以充分实现其在皮肤癌诊疗中的潜力。
