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Vibrio natriegens是一种极具前景的生物技术底盘菌株，以其极快的生长速度和动态代谢而著称。该微生物既可通过成熟的MtrCAB电子输出系统直接将电子传递至电极，也可通过氧化还原穿梭分子进行介导传递。值得注意的是，介导电子转移（mediated el
Vibrio natriegens是一种极具前景的生物技术底盘菌株，以其极快的生长速度和动态代谢而著称。该微生物既可通过成熟的MtrCAB电子输出系统直接将电子传递至电极，也可通过氧化还原穿梭分子进行介导传递。值得注意的是，介导电子转移（mediated electron transfer, MET）可产生更高的电流。生物电化学系统通过将阳极设定为末端电子受体，有望影响V. natriegens的代谢产物谱。本研究系统评估了十二种介体，其氧化还原电位窗口为?520至+490 mV（vs Ag/AgCl (3 M KCl)），以建立V. natriegens的高效MET。在测试化合物中，铁氰化钾（potassium ferricyanide, FEC）产生了最高的电流密度（104 ± 20 μA cm?2）和法拉第效率。值得注意的是，核黄素（riboflavin）的穿梭循环次数少于0.05次，表明其电子穿梭能力较低。相比之下，吩嗪类化合物表现出从V. natriegens细胞摄取电子的效率，但电流产生不稳定。总体而言，识别出一个高于?220 mV（vs Ag/AgCl）的特定氧化还原电位窗口，在该窗口内介体还原最有效率。这些发现建立了兼容的氧化还原穿梭体目录，并为利用V. natriegens提高生物电化学过程效率奠定了基础。
Vibrio natriegens是一种具有极快生长速度和动态代谢的革兰氏阴性非致病菌，被认为是极具潜力的生物技术底盘。然而，其成膜能力较差，限制了通过生物膜与阳极直接接触进行直接电子传递的效率。介导电子转移（mediated electron transfer, MET）利用氧化还原介体在细胞与电极之间穿梭电子，可显著扩大相互作用界面并提高电子传递速率。已有研究仅测试了少数介体，缺乏系统比较。本研究旨在系统评估一系列氧化还原介体，找出兼具良好生物相容性、水溶性和电子穿梭效率的最佳候选，并为电化学控制的生物过程奠定基础。
研究人员在微型化生物电化学系统中，同时采用计时电流法和在线分光光度法，系统评估了12种氧化还原介体（电位跨度?520至+490 mV vs Ag/AgCl (3 M KCl)），以葡萄糖为碳源和能源。结果发现，铁氰化钾（FEC）产生最高的电流密度（104±20 μA cm
?2）和法拉第效率；核黄素穿梭循环极低（<0.05次）；吩嗪类化合物虽具有电子摄取效率但电流不稳定。研究还确定了高效介体还原的氧化还原电位窗口（高于?220 mV vs Ag/AgCl）。这些发现为利用V. natriegens的高效生物电化学过程提供了介体目录和理论基础。
关键的技术方法如下：研究人员使用自主开发的微型化生物电化学系统（eCuvette），由8个4 mL聚苯乙烯比色皿组成，集成丝网印刷金电极（碳电极用于核黄素验证）和Ag/AgCl (3 M KCl)参比电极，持续通入氮气维持厌氧。通过计时电流法在固定阳极电位下记录电流，同时用紫外-可见分光光度计监测介体特征波长吸光度变化，结合校准曲线计算最大还原速率和每分子平均循环数。使用高效液相色谱（HPLC）测定葡萄糖和发酵产物，计算法拉第效率。利用AlphaFold 3预测MtrCAB复合物结构。菌株V. natriegens DSM 759购自DSMZ，预培养于改良M1培养基。介体浓度依据先前对Cupriavidus necator的筛选研究确定。
### 2.1 最大介体还原速率
通过监测各介体在特征波长的吸光度下降并结合校准曲线，计算了最大还原速率。FEC因使用浓度最高（1000 μmol L
?1）而表现出最高的还原速率（571.25±15.00 μmol L
?1 h
?1），并产生最高电流密度。2,6-二氯酚靛酚（DCIP）的初始还原速率虽高（131.21±24.63 μmol L
?1 h
?1），但电流密度仅9.49±3.94 μA cm
?2，且葡萄糖剩余>80%，表明DCIP对V. natriegens代谢具有抑制作用。核黄素（RF）无法通过光度法检测到还原，电流密度仅约0.5 μA cm
?2，说明其氧化还原电位不利于该菌株有效还原。ABTS则可被还原，提示存在细胞外相互作用位点。
### 2.2 每个氧化还原分子的平均循环数
通过积分接种后10 h的电流-时间曲线，计算了每个介体分子平均穿梭的电子循环数。FEC和甲基红（MR）表现出最高的循环数，表明V. natriegens对这两种化合物具有高还原亲和力。与缺乏天然EET机制的C. necator相比，V. natriegens还原FEC的速率快约10倍，而C. necator还原PMS的速率却快约20倍，提示吩嗪类介体的还原可能与细胞生长状态密切相关。ABTS在C. necator中完全无活性，但在V. natriegens中有活性，进一步支持ABTS仅作用于细胞表面的机制。
### 2.3 葡萄糖消耗与法拉第效率
通过HPLC分析实验结束时的葡萄糖、有机酸和乙醇浓度，计算了法拉第效率（FE）。FEC的FE最高（5%±2.1%），其他介体平均低于3%。DCIP和RES导致葡萄糖消耗显著降低（<60%），表明其在所用浓度下具有抑制作用。其余介体不影响葡萄糖消耗，说明还原效率差异并非代谢抑制所致，而是阳极电子传递路径的限制。由于PMS和PES的发酵产物电子数计算超过100%，因此未扣除有机酸，直接报告从消耗葡萄糖到阳极的电子传递百分比。
### 2.4 FEC和PMS的计时电流分析
选取FEC和PMS进行详细分析。电流的产生与介体氧化态吸光度下降呈反比，证实电流来自细菌对介体的还原。无细胞对照电流很低。FEC体系中电流密度可达104±20 μA cm
?2，与搅拌釜生物反应器相当。PMS在约2 h内产生电流，随后电流下降，同时细胞生长停滞，但葡萄糖仍存在，提示吩嗪类物质的细胞毒性（如活性氧产生或厌氧条件下能量不足导致的自毒作用）导致电流衰减。未添加介体的对照实验仍可检测到电流，证明V. natriegens具有天然EET活性。
### 2.5 计算蛋白折叠
使用AlphaFold 3预测V. natriegens MtrCAB复合物结构，模型质量指标为pLDDT 70–90、ipTM 0.79、pTM 0.8。预测显示血红素基团从周质侧经MtrA以线性方式排列，并通过MtrC的多个出口位点将电子传递给胞外溶解介体。MtrC亚基相对于MtrAB复合物存在显著旋转，但仍允许氧化还原分子接触。该结构支持了高于?220 mV的介体还原效率更高与MtrCAB表面血红素相互作用的假设。对于除ABTS外的介体，电流可能来自细胞外MtrCAB氧化和跨膜过程的共同贡献。
讨论部分指出，ABTS在V. natriegens中可被还原而在无EET机制的C. necator中完全无活性，提示ABTS可作为革兰氏阴性菌EET能力的探针。AlphaFold结构预测支持V. natriegens通过MtrCAB表面暴露的血红素直接与溶解介体相互作用的机制。识别出的电位窗口（高于?220 mV vs Ag/AgCl）与MtrCAB血红素的氧化还原特性相符。结论部分可翻译为：研究人员系统评估了12种氧化还原介体，以建立V. natriegens的MET。其中，铁氰化钾表现最佳，产生最高的电流密度和法拉第效率；甲基红、ABTS和多种吩嗪类化合物也表现出显著电化学活性。研究确定了高于?220 mV vs Ag/AgCl (3 M KCl)的电位窗口，在此窗口内V. natriegens能高效还原介体。ABTS的还原能力（与C. necator对比）提示其可作为EET探针。计算折叠研究支持V. natriegens利用MtrCAB表面血红素直接与溶解介体相互作用。未来研究应进一步阐明介体与MtrCAB复合物及周质/胞内位点的相互作用程度。这些发现通过利用快速生长的V. natriegens与铁氰化钾的稳定电子传递，为开发高效、稳定的生物电化学过程奠定了基础。
