保护CEACAM1表达预防饮食诱导的雄性小鼠代谢功能障碍与肝纤维化

《Obesity》：Protecting CEACAM1 Expression Prevents Diet-Induced Metabolic Dysfunction and Hepatic Fibrosis in Male Mice

　　

摘要专业翻译 目的：高脂饮食通过PPARα介导的机制抑制Ceacam1转录，从而在炎症发生前引起胰岛素抵抗。本研究探讨了突变Ceacam1启动子中的PPRE-RXRα是否能预防饮食诱导的雄性C57BL6/J小鼠代谢异常和肝纤维化。 方法：研究人员建立了一个敲入（knock-in, KI）小鼠品系，其Ceacam1启动子上的PPRE-RXRα携带突变。将雄性小鼠分别喂食普通饲料、高脂饮食（high-fat diet, HFD）或GAN饮食（Gubra Amylin NASH diet）1至4个月，随后通过高胰岛素-正葡萄糖钳夹（hyperinsulinemia-euglycemia clamp）分析评估体内胰岛素作用，并通过间接测热法分析能量平衡。采用苏木精-伊红（H&E）染色和天狼星红（Sirius Red）染色分别检测脂肪性肝炎和肝纤维化。 结果：喂食HFD或GAN饮食1至4个月后，野生型（wild-type, WT）小鼠肝脏CEACAM1表达受到抑制，而KI小鼠则未受抑制。突变PPRE-RXRα阻止了饮食诱导的胰岛素清除受损，从而维持了正常胰岛素血症和胰岛素敏感性。与WT小鼠不同，HFD未能降低KI小鼠的能量消耗和自发活动能力。喂食GAN饮食4个月导致WT小鼠出现Th1型炎症反应和肝纤维化，而KI小鼠则未出现。 结论：阻断CEACAM1表达的抑制，同时维持内源性调控机制和正常生理条件，足以遏制饮食诱导的代谢失调、脂肪变性、能量失衡及代谢功能障碍相关脂肪性肝炎（MASH）进展。

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一、研究背景与研究目的

1. 研究背景与现存问题

CEACAM1（癌胚抗原相关细胞黏附分子1）是一种保守的跨膜糖蛋白，在肝细胞中高表达。其长亚型（CEACAM1-4L）定位于肝血窦域，通过磷酸化依赖的方式促进受体介导的胰岛素摄取和降解，是肝脏清除胰岛素的关键分子。已有研究表明，高脂饮食（HFD）可通过脂肪酸激活PPARα（过氧化物酶体增殖物激活受体α），后者结合于Ceacam1启动子中高度保守的PPRE-RXRα顺式作用元件，从而抑制Ceacam1转录。短期（约14天）HFD摄入对Ceacam1的轻度抑制尚可作为脂肪酸β氧化（FAO）的正反馈调节机制，维持胰岛素代谢和作用的正常。然而，长期（≥21天）HFD摄入会抑制CEACAM1表达达50%以上，导致肝脏和肾脏胰岛素清除功能受损，引发高胰岛素血症。慢性高胰岛素血症进而驱动胰岛素抵抗、肝脏从头脂肪合成（DNL）、极低密度脂蛋白甘油三酯（VLDL-TG）向白色脂肪组织（WAT）重分布以及内脏肥胖。此外，CEACAM1的缺失或失活即使在普通饲料喂养条件下也能导致自发性肝纤维化。鉴于富含脂肪、蔗糖、果糖和胆固醇的GAN饮食（Gubra Amylin NASH饮食）可在C57BL6/J小鼠中同时诱导肝纤维化和代谢功能障碍相关脂肪性肝炎（MASH）的其他特征，研究人员提出假说：GAN饮食的作用主要通过脂肪酸激活的PPARα抑制CEACAM1表达来介导，而非通过其他饮食改变的机制。

2. 研究目的

本研究旨在验证：通过突变Ceacam1启动子中的PPRE-RXRα，阻止活化PPARα与该元件的结合，同时维持内源性调控机制，能否预防饮食诱导的胰岛素抵抗、肝脏脂肪变性和肝纤维化。

二、研究方法

研究人员利用CRISPR/Cas9基因编辑技术在耶鲁大学免疫生物学基因编辑设施建立了敲入（KI）小鼠品系，该品系携带Ceacam1启动子中PPRE-RXRα序列的突变（ΔPPRE-RXRα）。F1杂合子小鼠与C57BL6/J小鼠回交超过6代。实验对象为2月龄雄性小鼠，分别喂食普通饲料（RD）、高脂饮食（HFD，含45%千卡来自脂肪）或GAN饮食（含40%千卡来自脂肪、20%果糖、2%蔗糖、2%胆固醇）1至4个月。主要技术方法包括：高胰岛素-正葡萄糖钳夹分析（评估体内胰岛素作用）、间接测热法（CLAMS系统，分析能量平衡）、Western印迹（检测肝脏CEACAM1蛋白水平）、H&E染色（评估NAFLD活动度评分[NAS]）、天狼星红染色（检测胶原沉积）、免疫组化（IHC，检测Mac2、CD68、CD4、CD8、Foxp3等免疫细胞标志物）以及实时定量PCR（RT-qPCR，检测炎症和纤维化相关基因mRNA水平）。

三、研究结果

3.1 HFD降低野生型而非KI雄性小鼠肝脏CEACAM1蛋白水平并损害胰岛素清除

Western印迹结果显示，1个月HFD摄入使WT小鼠肝脏CEACAM1蛋白水平降低约60%，而KI小鼠未受影响。这导致WT小鼠肝脏胰岛素清除受损（由稳态C肽/胰岛素摩尔比评估），引起持续至4个月的高胰岛素血症。相比之下，KI小鼠即使经4个月HFD摄入仍维持正常的胰岛素清除和正常胰岛素血症。

3.2 HDF对体内胰岛素作用的影响

1个月HFD摄入导致WT小鼠出现葡萄糖不耐受和胰岛素抵抗，而KI小鼠未受影响。4个月HFD后的高胰岛素-正葡萄糖钳夹分析显示，虽然HFD降低了两种小鼠的葡萄糖输注率（GIR），但KI小鼠的GIR仍维持在WT-RD水平，约为HFD-WT小鼠的1.7倍，表明KI小鼠保持了全身胰岛素敏感性。HFD抑制WT小鼠肝脏葡萄糖产生和骨骼肌葡萄糖处置的能力分别下降约40%，而KI小鼠不受影响。此外，KI小鼠在两种饮食条件下的全身糖原合成和糖酵解均高于WT小鼠。

3.3 HDF对脂质稳态的影响

HFD诱导两组小鼠同等程度的内脏肥胖和体重增加。但HFD-KI小鼠的血浆非酯化脂肪酸（NEFA）水平低于HFD-WT小鼠，表明脂肪分解更受限。KI小鼠的肝脏甘油三酯（TG）含量显著低于WT小鼠，这与KI小鼠脂肪酸β氧化（FAO）升高有关，尽管两组小鼠的脂肪酸合酶（FASN）活性增加幅度相似。H&E染色显示KI小鼠肝脏实质脂滴沉积和炎性细胞浸润均少于WT小鼠。

3.4 HDF对能量平衡的影响

间接测热法显示，KI小鼠的每日摄食量与WT小鼠相当，但其耗氧量（VO₂）、产热量、二氧化碳产量（VCO₂）和呼吸交换率（RER）均高于WT小鼠，表明KI小鼠能量消耗更高且更依赖碳水化合物代谢。HFD降低了这些参数，但KI小鼠仍维持较高水平。KI小鼠的自发体力活动也高于WT小鼠。在禁食-再喂养转换过程中，HFD-KI小鼠的RER仍高于HFD-WT小鼠，与其更高的FAO一致。

3.5 GAN饮食在野生型而非KI小鼠中引起炎症反应

4个月GAN饮食同样降低了WT小鼠肝脏CEACAM1蛋白水平，而KI小鼠未受影响。GAN饮食导致WT小鼠出现高胰岛素血症和胰岛素抵抗（HOMA-IR升高），而KI小鼠未出现。GAN饮食引起两组小鼠葡萄糖不耐受，但KI小鼠程度较轻。GAN饮食诱导WT小鼠肝脏出现更显著的大泡性脂肪变性、多处小叶炎性浸润灶，NAS评分为6分（KI为4分）。免疫组化和RT-qPCR分析显示，GAN饮食在WT小鼠中诱导了更多的巨噬细胞募集（Mac2）和活化（CD68）、中性粒细胞髓过氧化物酶（MPO）mRNA升高、促炎性CD4⁺和CD8⁺T细胞增多，以及肝脏IL-6和TNFα mRNA水平升高，而在KI小鼠中这些效应几乎消失。抗炎性Treg（Foxp3）和IL-10 mRNA水平在两组中均无变化。这些结果表明GAN饮食在WT小鼠中选择性促进了Th1型炎症反应。

3.6 GAN饮食在野生型而非KI小鼠中引起肝纤维化

天狼星红染色显示，GAN饮食在WT小鼠肝脏实质中诱导了间质性和桥接性胶原纤维沉积，阳性面积较KI小鼠增加2至3倍。RT-qPCR分析证实，WT小鼠肝脏中促纤维化标志物Acta2、Col1α1、Col3α1和Tgfβ的mRNA水平升高，内皮素-1（Et-1）及其促纤维化A受体（Et_ar）的mRNA相对于抗纤维化B受体（Etbr）优先升高。而在KI小鼠中，GAN饮食的这些促纤维化效应显著减弱。

四、讨论与结论

本研究表明，突变Ceacam1启动子中的PPRE-RXRα可保护其表达免受饮食抑制，同时维持正常生理条件下的内源性调控机制。保护CEACAM1表达可预防饮食诱导的高胰岛素血症驱动的胰岛素抵抗和肝脏脂肪变性，并能抑制长期GAN饮食引起的Th1炎症反应和肝纤维化。这证明CEACAM1抑制是MASLD独立导致肝纤维化的机制基础，尤其在衰老人群中。

KI小鼠表现出更高的体力活动和能量消耗，这可能与改善的骨骼肌葡萄糖摄取和胰岛素敏感性有关，从而为体力活动提供更多能量支持。尽管HFD诱导了两组小鼠FASN活性，但只有KI小鼠同时出现FAO升高，表明持续的PPARα激活通过偶联合成与增强氧化代谢促进了更平衡的肝脏脂质代谢。高胰岛素-正葡萄糖钳夹分析证实，HFD对KI小鼠胰岛素敏感性的不良影响远小于WT小鼠。

GAN饮食在WT小鼠中引起的肝纤维化与高胰岛素血症密切相关，这与研究人员此前报道的肝脏特异性CEACAM1失活小鼠中高胰岛素血症通过激活α5β1整合素/FAK信号通路促进胶原生成的发现一致。KI小鼠中Et-1/Et_ar表达的降低进一步支持了这一机制。

研究结论：保护全身CEACAM1表达可预防西方饮食对胰岛素和脂质代谢以及肝损伤的长期影响。结合胰岛素增敏剂（如PPARγ激动剂、维甲酸和GLP1受体激动剂）可诱导Ceacam1转录的证据，本研究数据将CEACAM1确定为预防饮食诱导的胰岛素抵抗、脂毒性和肝纤维化的有前景的治疗靶点。