S-Equol通过调控ERβ–AMPK–自噬轴缓解棕榈酸诱导的L6细胞肌肉萎缩

《Journal of Nutrition and Metabolism》：S-Equol Alleviates Palmitic Acid–Induced Muscle Atrophy by Modulating the ERβ–AMPK–Autophagy Axis in L6 Cells

　　

背景：糖尿病肌少症源于代谢失衡诱导的活性氧（ROS）蓄积和氧化应激，后者加剧肌肉退变。通常，自噬清除过量ROS和受损细胞器，有助于限制氧化应激并维持骨骼肌功能。S-Equol（Eq）是大豆异黄酮的肠道代谢产物，对雌激素受体β（ERβ）具有高亲和力，表现出雌激素样活性，但其在糖尿病性肌肉萎缩中的作用尚不清楚。目的：本研究探讨Eq在棕榈酸（PA）诱导的萎缩L6肌管中对糖尿病性肌肉萎缩的作用。方法：研究人员采用PA处理的L6肌管模拟糖尿病相关萎缩，进一步给予Eq处理，并检测氧化应激、线粒体形态和自噬。结果：PA抑制AMP活化蛋白激酶（AMPK）/UNC-51样激酶1（ULK1）介导的自噬，诱导ROS蓄积，破坏线粒体形态，并导致肌管萎缩。Eq处理恢复了自噬活性，显著降低ROS和丙二醛（MDA）水平，维持线粒体完整性和功能，并保持肌管结构。重要的是，用3-甲基腺嘌呤（3-MA）抑制自噬可废除Eq的保护作用，证实其抗萎缩作用是自噬依赖性的。机制上，敲低ERβ或AMPK可阻止Eq激活自噬，提示ERβ–AMPK信号轴参与Eq介导的自噬调控。结论：研究人员的发现表明，Eq通过促进自噬缓解PA诱导的肌管萎缩，可能通过调节ERβ–AMPK信号轴实现。这些结果凸显Eq作为预防和治疗糖尿病肌少症的潜在营养疗法。

糖尿病肌少症是2型糖尿病（Type 2 diabetes mellitus, T2DM）的常见并发症，以骨骼肌质量与功能进行性丧失为特征，增加跌倒、骨折和死亡风险。其发病机制与代谢失衡导致的活性氧（reactive oxygen species, ROS）蓄积及氧化应激密切相关。自噬是溶酶体介导的细胞降解过程，可清除过量ROS和受损线粒体，维持骨骼肌稳态。AMP活化蛋白激酶（AMP-activated protein kinase, AMPK）/UNC-51样激酶1（UNC-51-like kinase 1, ULK1）通路是调控自噬的关键信号轴。既往研究显示雌激素可激活AMPK、促进自噬并保护肌肉，但雌激素替代存在风险。S-Equol（Eq）是大豆异黄酮在肠道中的代谢产物，与雌二醇结构相似，对雌激素受体β（estrogen receptor β, ERβ）具有高亲和力，具有类雌激素活性，但其是否改善糖尿病性肌肉萎缩尚不清楚。因此，本研究采用棕榈酸（palmitic acid, PA）处理L6肌管模拟糖尿病状态下的肌肉萎缩，探讨Eq的作用及机制。

研究方法：该研究以来自陆军军医大学营养与食品安全研究中心的大鼠L6成肌细胞分化形成的肌管为模型，采用0.25 mM PA处理诱导萎缩，并给予1 μM Eq干预。检测手段包括CCK-8细胞活力、HE染色评估肌管形态、葡萄糖氧化酶法测葡萄糖消耗、ROS荧光探针和丙二醛（malondialdehyde, MDA）检测氧化应激、JC-1探针测线粒体膜电位、透射电镜观察线粒体超微结构、LC3B慢病毒转染评估自噬、Western blot检测蛋白表达，以及siRNA敲低ERβ或AMPK验证信号通路。数据分析采用单因素方差分析和Tukey-Kramer事后检验。

研究结果：
3.1 PA抑制自噬并诱导肌管萎缩：0.25 mM PA显著减小肌管直径、降低肌球蛋白重链（Myosin Heavy Chain, MyHC）蛋白水平，同时抑制AMPK磷酸化、升高LC3-I/LC3-II比值和p62表达，并剂量依赖性增加ROS和MDA，表明PA通过抑制自噬导致氧化应激和萎缩。
3.2 Eq促进萎缩肌管中的自噬：1 μM Eq增加肌管直径和MyHC表达，增强LC3B荧光共定位，提高AMPK和ULK1磷酸化，降低p62和LC3-I/LC3-II比值；自噬抑制剂3-甲基腺嘌呤（3-methyladenine, 3-MA）逆转这些效应，说明Eq以自噬依赖性方式发挥作用。
3.3 Eq缓解PA诱导的肌管萎缩和氧化应激：Eq恢复PA所致的肌管直径减小和MyHC下降，显著降低ROS和MDA水平；3-MA消除这些保护作用，证明Eq减轻萎缩和氧化应激依赖于自噬。
3.4 Eq改善PA诱导的线粒体功能障碍：PA引起线粒体分裂增加、融合减少，降低线粒体融合蛋白2（MFN2）/线粒体分裂蛋白1（DRP1）比值，线粒体形态变圆、数量减少、膜电位下降，并降低葡萄糖消耗；Eq恢复线粒体细长形态和膜电位，增加自噬体，提高MFN2/DRP1比值和葡萄糖消耗；3-MA阻断这些改善，提示Eq通过自噬维持线粒体稳态和能量代谢。
3.5 敲低ERβ或AMPK抑制Eq的促自噬作用：在对照siRNA细胞中，Eq恢复PA抑制的AMPK/ULK1磷酸化并降低p62和LC3-I/LC3-II；但在si-ERβ或si-AMPK细胞中，Eq无法产生这些效应。单纯敲低ERβ即抑制自噬标记物，表明ERβ是自噬调控的重要上游分子。这证实Eq通过ERβ–AMPK–ULK1轴激活自噬。

讨论总结：本研究揭示PA诱导的肌管萎缩与自噬抑制、ROS蓄积和线粒体损伤密切相关。Eq作为类雌激素化合物，通过ERβ激活AMPK/ULK1通路，恢复自噬并清除ROS，保护线粒体形态和功能，从而缓解萎缩。3-MA和基因敲低实验证实该过程依赖自噬及ERβ–AMPK轴。研究还提出，膳食大豆来源的Eq可能成为T2DM患者防治肌少症的营养干预策略，未来需在动物模型中验证，并关注产Eq肠道菌群及其代谢产物。

研究结论：本研究显示，PA处理的L6肌管出现ROS水平升高、线粒体结构紊乱和肌管萎缩，模拟糖尿病条件下的肌肉萎缩；而Eq通过ERβ–AMPK–ULK1通路增强自噬，进而减少ROS蓄积、维持线粒体完整性并防止肌管萎缩。这些发现强调了膳食或治疗性Eq在预防和治疗糖尿病肌少症中的潜力，为改善T2DM患者的骨骼肌健康和生活质量提供了策略。