《Scientific Data》：The FunAqua dataset of global fungal biodiversity in aquatic ecosystems
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高通量DNA测序技术的进步加速了对水生微生物、其多样性及生态功能的研究，同时也显著推进了对塑造水生生态系统和食物网的真菌的研究。研究人员在此介绍FunAqua数据集，该数据集基于来自87个国家1,452个采样点的1,076份沉积物样品和1,299份过滤水样品的
高通量DNA测序技术的进步加速了对水生微生物、其多样性及生态功能的研究，同时也显著推进了对塑造水生生态系统和食物网的真菌的研究。研究人员在此介绍FunAqua数据集，该数据集基于来自87个国家1,452个采样点的1,076份沉积物样品和1,299份过滤水样品的真核长读长宏条形码（metabarcoding）数据，描述了水生生态系统中的全球真菌生物多样性。研究靶向内部转录间隔区（internal transcribed spacer, ITS）区域，共记录到50,152个真菌操作分类单元（operational taxonomic unit, OTU）。测序数据附有全面的样品元数据，包括水和沉积物的理化数据。FunAqua数据集为分析和更好理解不同生物地理区域各类水生栖息地中真菌的生物多样性提供了新资源。本数据论文所述数据集将定期更新，纳入额外的宏条形码数据。
**一、研究背景与科学问题**
真菌广泛存在于水生环境中，在淡水和海洋栖息地中均有分布，主要通过寄生、分解或共生等方式发挥生态功能。寄生真菌可调节有毒藻华，并产生浮游动物可食用的游动孢子，通过mycoloop机制促进营养级联传递；淡水溪流中植物材料（如叶片、枝条和花粉）的分解主要由真菌驱动；丛枝菌根真菌（arbuscular mycorrhizal fungi）可定殖水生植物根系，同时还存在半水生地衣及其相应的地衣生真菌。然而，与其他水生微生物和陆生真菌相比，水生真菌研究严重不足，其全球多样性记录匮乏。宏条形码研究揭示了大量缺乏生态学、分类学和形态学描述的水生暗物质真菌（dark matter fungi）。尽管高通量测序技术已揭示出远超传统显微观察和培养方法所检测到的水生真菌多样性，但全球范围内关于水生真菌多样性及分布的知识仍然有限，水样来源的真菌序列在参考数据库中代表性不足。已有在线资源如marinefungi.org和freshwaterfungi.org分别记录海洋和淡水真菌，ParAquaSeq数据库包含游动孢子寄生真菌的rRNA序列，但缺乏全球范围、统一方法论的公开宏条形码数据集。此外，从已发表测序数据中汇编数据集面临方法学差异和元数据不足等挑战，可能影响研究结果并限制比较分析能力。为此，研究人员发起了全球合作项目FunAqua，旨在探索和记录水生生态系统中的真菌多样性及其塑造生物多样性的环境因素。
**二、研究内容与总体结论**
研究人员基于来自全球87个国家1,452个采样点的1,076份沉积物样品和1,299份过滤水样品，通过扩增和测序完整的ITS区域（平均扩增子长度866 bp），构建了FunAqua数据集。该数据集共记录到50,152个高质量真菌OTU，并附有全面的样品元数据以及水和沉积物的理化数据。该数据集为分析和理解不同生物地理区域各类水生栖息地中真菌的生物多样性提供了新资源，并将随着新样品的分析而持续更新。
**三、主要关键技术方法**
研究人员采用了以下主要技术：（1）标准化样品采集协议（含基本版和高级版），样品集中送至爱沙尼亚生命科学大学（EMU）注册保存，分子分析在塔尔图大学（UT）真菌学与微生物学中心完成；（2）基于PacBio Sequel II系统的长读长宏条形码测序，使用ITS9mun/ITS4ngsuni引物对扩增完整ITS区域；（3）基于NextITS工作流程（Nextflow编排、Singularity容器化）的生物信息学分析，包括LIMA去多重化、cutadapt引物修剪、ITSx结构验证、VSEARCH嵌合体过滤、UNOISE3降噪及98%相似度聚类；（4）基于EUKARYOME v1.9.3参考数据库的BLASTn分类注释与多步骤质量控制；（5）水样化学分析（电导率、pH、总磷、总氮）和沉积物微波消解及MP-AES元素分析。
**四、研究结果**
*地点数据验证*。研究人员通过Google Maps对每个水体的经纬度记录进行人工验证，符合水体匹配、邻近城市或区域匹配等标准的地点标记为已验证，未通过验证的地点由FunAqua协调员联系数据采集者确认或修正坐标。
*采样覆盖*。1,452个采样点中63%（920个）同时具有沉积物和过滤水样品。欧洲样品占56%，为最大比例。最大比例样品来自淡水湖（44%），其次为淡水河（32%）、咸水海洋（14%）和半咸水海洋（7%）；红树林（16份）、咸水湖（12份）、半咸水湖（10份）、盐沼（9份）、温泉（7份）和淡水泉（3份）代表性较低。
*污染控制*。每个测序文库和PCR反应均包含阳性和阴性对照。28个阴性对照中有19个检出真菌OTU，多数为低质量或可能来自阳性对照的污染。被判定由污染引起的OTU已从数据集中移除，未发现文库规模的广泛污染。
*生物信息学验证*。通过严格的序列和结构过滤验证扩增子完整性和标记正确性。仅保留包含完整索引组合、双引物方向正确的读段。ITSx处理要求检测到的rRNA区域（SSU、ITS1、5.8S、ITS2、LSU）顺序正确且无重叠，且所有亚区域匹配同一主要真核谱系。
*分类学验证*。采用多步骤质控程序：OTU通过BLASTn比对EUKARYOME参考数据库，仅在满足序列一致性≥65%、比对覆盖度≥40%和E值e-50阈值时保留注释；对已知问题类群进行人工检查；基于序列质量、丰度和插入缺失数等标准标记低质量OTU。
*测序深度与分类覆盖*。共获得13,064,293条读段（真菌2,888,694条；非真菌10,175,599条），聚类产生496,061个真核OTU，其中132,417个（27%）为真菌。经质控后，137,808个高质量OTU中真菌占36.4%（50,152个OTU；2,065,407条读段）。沉积物中的真核OTU数（90,865）高于水样（74,110），27,167个OTU为两类样品共有。真菌OTU在98%的沉积物样品和93%的过滤水样品中检出。79%的样品达到充分测序深度（Good's coverage C>0.89），总覆盖度中位数为0.97；真菌OTU分析显示57%的样品达到阈值。稀释曲线显示大多数样品达到或接近饱和，但真菌OTU累积曲线表明测序深度不足以在所有样品中达到饱和。
*真菌分类覆盖*。在门水平上，子囊菌门（Ascomycota）最丰富，占35.6%（17,858个OTU），其次为罗兹菌门（Rozellomycota，21.6%）、壶菌门（Chytridiomycota，14.7%）和担子菌门（Basidiomycota，13.6%）。沉积物和水样间门水平组成存在明显差异：沉积物中Ascomycota占39.0%、Rozellomycota占23.6%，而水样中分别为31.5%和19.7%；水样中Chytridiomycota占19.5%，远高于沉积物的11.6%。在纲水平上，未鉴定的Rozellomycota类群最丰富（20.7%），粪壳菌纲（Sordariomycetes）在沉积物中占优势，伞菌纲（Agaricomycetes）在水样中占优势。在目水平上，未鉴定的Rozellomycota目在两类样品中均最丰富；Helotiales是沉积物中最丰富的目，而Rhizophydiales在水样中最丰富。大陆尺度上，欧洲样品具有最高的高质量真菌序列数（1,371,636条读段；35,523个OTU），其次为北美洲和亚洲；生物群系尺度上，淡水河流包含最多真菌序列（983,828条；31,267个OTU）。
**五、讨论与结论**
在讨论部分，研究人员指出数据集使用中需注意：低测序深度样品可能低估真菌OTU丰富度，建议按研究问题进行过滤、稀释或校正；98%相似度聚类可能合并密切相关的类群（如某些丝状子囊菌）或分裂变异较大的物种（如壶菌）；数据集无法区分活跃生长的水生真菌、落入水中的颗粒附生生物或沉积孢子，因此推断真菌活性、生活
