抑制USP2可抑制病理性过氧化物酶体自噬并挽救PEX1缺陷型过氧化物酶体生物发生障碍

《Signal Transduction and Targeted Therapy》：Inhibition of USP2 suppresses pathological pexophagy and rescues PEX1-deficient peroxisome biogenesis disorder

　　

过氧化物酶体生物发生障碍（peroxisome biogenesis disorders，PBDs）是一类极罕见、危及生命的遗传性疾病，其功能性过氧化物酶体病理性丧失，导致以神经系统受累为主的进行性多系统衰竭。临床上，PBDs涵盖于泽尔韦格谱系疾病（Zellweger spectrum disorders，ZSDs），其范围从危及生命的新生儿期发病到伴有终身神经发育及运动障碍的较轻型。遗传学上，ZSD由Peroxin（PEX）基因的双等位基因变异引起，其中PEX1是主要致病位点，约占各队列病例的65%。PEX1属于过氧化物酶体AAA-ATP酶复合物，参与基质蛋白导入，因此PEX1缺陷主要损害过氧化物酶体酶导入。近期研究进一步表明，PEX1突变或缺失可诱发过度的过氧化物酶体选择性自噬（病理性过氧化物酶体自噬，pathological pexophagy），加速过氧化物酶体耗竭；尽管广谱自噬阻断（如氯喹/CQ）提供了概念验证性挽救效果，但其本质上缺乏选择性，并存在机制及转化方面的不足。由于过氧化物酶体丰度反映细胞器生物发生/导入与选择性降解之间的平衡，PEX1突变细胞可能不仅通过基质蛋白导入缺陷，还通过主动清除受损过氧化物酶体而丢失过氧化物酶体。由于过氧化物酶体自噬由过氧化物酶体膜蛋白的泛素化启动，上游泛素编辑机制可能比全局自噬阻断提供更具选择性的靶点。研究人员因此推测，缺陷型PEX1通过一个可成药的泛素化相关调控因子驱动病理性过氧化物酶体自噬，靶向该调控因子可选择性地调节适应不良性过氧化物酶体自噬。为识别PEX1缺陷情境下的可成药检查点，研究人员以ABCD3阳性过氧化物酶体斑点为读值，在PEX1-G843D患者来源成纤维细胞中筛选了一个聚焦的泛素相关化合物库。ML364（一种泛素特异性肽酶2（ubiquitin-specific peptidase 2，USP2）抑制剂）被选为最佳候选化合物，可恢复过氧化物酶体丰度。与药理学结果一致，USP2敲低可增加PEX1-G843D成纤维细胞中的过氧化物酶体丰度。同时，ML364以剂量依赖方式恢复PEX1-G843D成纤维细胞中ABCD3阳性过氧化物酶体斑点，且不影响野生型成纤维细胞中的过氧化物酶体丰度，并在另一独立PEX1突变患者来源成纤维细胞系GM16513（携带PEX1 2097insT）中同样恢复过氧化物酶体丰度。值得注意的是，脂质分析进一步显示，ML364降低了PEX1-G843D成纤维细胞中升高的C26:0溶血磷脂酰胆碱（lysoPC）水平、C24:0 lysoPC水平以及C26:0/C16:0比值。综上，这些结果表明，USP2的药理学抑制可显著恢复PEX1缺陷患者来源细胞中的过氧化物酶体丰度，并部分改善极长链脂肪酸（VLCFA）相关异常。在PEX1缺陷情境下评估病理性过氧化物酶体自噬时，研究人员使用了EGFP–mCherry–PEX26TM串联报告系统，该系统可在不依赖PTS1基质导入的情况下监测过氧化物酶体向溶酶体的递送。溶酶体递送后，EGFP荧光易被淬灭而mCherry保留，产生EGFP(?)/mCherry(+)“仅红色”斑点，作为过氧化物酶体自噬通量的读值。与野生型细胞相比，PEX1-G843D成纤维细胞表现出显著增加的仅红色斑点，而ML364减少这些斑点并保留EGFP(+)/mCherry(+)双阳性过氧化物酶体，与过氧化物酶体自噬通量被抑制及过氧化物酶体丰度恢复一致。机制上，在PEX1-G843D成纤维细胞中验证的过氧化物酶体自噬相关E3连接酶中，ML364选择性降低STUB1，而不影响PEX2或MARCHF7。ML364诱导的STUB1表达降低可被蛋白酶体抑制所逆转，表明USP2抑制促进STUB1经蛋白酶体途径去稳定化，并支持STUB1是PEX1-G843D成纤维细胞中最相关的下游E3连接酶。同时，PEX1缺陷增加ABCD3泛素化，而ML364显著抑制PEX1-G843D成纤维细胞中ABCD3的泛素化。此外，共免疫沉淀分析显示USP2与STUB1相互作用，且USP2敲低增加PEX1-G843D成纤维细胞中STUB1的多聚泛素化。一致地，STUB1敲低抑制PEX1-G843D成纤维细胞中ABCD3的泛素化，进一步将STUB1与USP2依赖性过氧化物酶体膜蛋白泛素化调控联系起来。STUB1敲低还可挽救PEX1敲低诱导的过氧化物酶体丢失。综上，这些数据支持一个模型：USP2调控STUB1稳定性，从而在PEX1缺陷条件下促进病理性过氧化物酶体自噬。为建立体内相关性，研究人员使用了果蝇（Drosophila melanogaster）PEX1缺陷模型和人源化PEX1-G843D PBD模型。脂肪体特异性Pex1敲低或脂肪体表达hPEX1-G843D导致过氧化物酶体丢失。值得注意的是，ML364对USP2的药理学抑制可恢复人源化PEX1-G843D体内模型中与过氧化物酶体自噬相关的过氧化物酶体丰度。此外，组织特异性Usp2敲低产生了类似的挽救效果，从而在体内遗传学上验证Usp2是相关的靶点介导因子。综上，这些结果表明，遗传学或药理学靶向Usp2可逆转PEX1扰动驱动的体内过氧化物酶体耗竭，支持USP2作为抑制病理性过氧化物酶体自噬的可成药治疗靶点。已有报道称，临床研究和果蝇模型将ZSD/过氧化物酶体缺陷与轴突肿胀及伴随的运动障碍联系起来。在30日龄果蝇中，胶质细胞Pex1敲低诱导腹部腹纵肌神经肌肉接头处轴突肿胀，并显著降低攀爬能力。值得注意的是，胶质细胞Usp2敲低减轻了Pex1敲低情境下的轴突肿胀并改善运动活性。综上，这些发现支持USP2是体内PEX1缺陷相关神经轴突病理及运动功能障碍的可靶向决定因素。总之，研究人员将USP2鉴定为PEX1缺陷情境下病理性过氧化物酶体自噬的调控因子。在从患者突变成纤维细胞到果蝇的多种PEX1缺陷模型中，USP2抑制均恢复了过氧化物酶体丰度并减轻了疾病相关表型。机制上，USP2维持STUB1稳定性，促进过氧化物酶体膜蛋白泛素化，并在PEX1缺失下维持异常过氧化物酶体自噬信号。这些发现强调USP2是PEX1相关PBD-ZSD的可操作靶点，通过选择性调节适应不良性过氧化物酶体自噬而非广泛抑制核心自噬发挥作用。这些发现应在以下背景下解读：基质蛋白导入缺陷仍是PBD-ZSD的主要致病缺陷，而病理性过氧化物酶体自噬可能进一步促进PEX1相关模型中的过氧化物酶体丢失。与CQ等非选择性晚期自噬抑制剂不同（后者在自噬体闭合后阻断自噬通量），USP2抑制似乎更早地通过抑制泛素依赖性过氧化物酶体自噬的起始步骤发挥作用。这种上游干预可能保留残留的、部分功能的过氧化物酶体。未来研究应明确USP2–STUB1相互作用及驱动STUB1去稳定化的泛素化位点。此外，USP2抑制剂的优化将需要ADME和药理学分析，并在更高等的PBD模型（包括iPSC来源疾病模型和小鼠模型）以及PEX1之外的其他PEX相关ZSD情境中进行验证。总之，研究人员的发现提出了一个发展过氧化物酶体自噬导向干预措施的机制框架，旨在系统层面纠正PEX1缺陷相关的细胞功能障碍，而非仅提供症状支持。

**论文解读：USP2作为PEX1缺陷型过氧化物酶体生物发生障碍的治疗靶点**

**一、研究背景与问题**

过氧化物酶体生物发生障碍（peroxisome biogenesis disorders，PBDs）是一类极罕见的遗传性疾病，以功能性过氧化物酶体的病理性丧失为核心特征，临床表现为进行性多系统衰竭，且以神经系统受累最为突出。该类疾病在临床上归属于泽尔韦格谱系疾病（Zellweger spectrum disorders，ZSDs），病情严重程度跨度大，从新生儿期致命性疾病到伴有终身神经发育与运动障碍的轻型均可见。遗传学上，ZSD由Peroxin（PEX）基因的双等位基因致病变异引起，其中PEX1是最主要的致病基因，约占各队列病例的65%。PEX1编码过氧化物酶体AAA-ATP酶复合物的组成亚基，该复合物为基质蛋白导入所必需，因此PEX1缺陷首先损害过氧化物酶体基质酶导入。

然而，近年研究发现，PEX1突变或缺失还可诱发过度的过氧化物酶体选择性自噬，即病理性过氧化物酶体自噬（pathological pexophagy），从而主动加速过氧化物酶体耗竭。过氧化物酶体丰度取决于细胞器生物发生/导入与选择性降解之间的动态平衡，因而PEX1突变细胞可能通过双重机制丢失过氧化物酶体：既有基质蛋白导入缺陷，又有损伤过氧化物酶体的过度清除。既往广谱自噬阻断剂（如氯喹CQ）虽能在概念上验证挽救效果，但其作用非选择性，存在机制和转化上的局限。过氧化物酶体自噬由过氧化物酶体膜蛋白的泛素化启动，因此上游泛素编辑机制可能成为更具选择性的治疗干预节点。基于此，研究人员提出假说：PEX1缺陷可能通过一个可成药的泛素化相关调控因子驱动病理性过氧化物酶体自噬，靶向该因子可选择性地抑制失调的自噬过程，从而保留残余的、部分功能性过氧化物酶体。

**二、研究目的与主要技术方法**

该研究旨在鉴定PEX1缺陷情境下调控病理性过氧化物酶体自噬的可成药检查点，并系统验证其药理学和遗传学靶向效应。研究者首先使用PEX1-G843D患者来源成纤维细胞，以ABCD3阳性过氧化物酶体斑点数为主要读出指标，筛选了一个聚焦的泛素相关化合物库；对筛选出的USP2抑制剂ML364进行了细胞水平验证。主要关键技术方法包括：患者来源成纤维细胞药物筛选与ABCD3免疫荧光计数；过氧化物酶体自噬通量分析采用EGFP–mCherry–PEX26TM串联报告系统，通过溶酶体递送后EGFP淬灭而mCherry保留产生“仅红色”斑点来定量自噬通量；使用免疫共沉淀和泛素化检测分析蛋白相互作用与翻译后修饰；通过LC–MS定量极长链脂肪酸（VLCFA）相关脂质指标；在果蝇（Drosophila melanogaster）模型中构建脂肪体特异性Pex1敲低、人源化PEX1-G843D表达以及胶质细胞Pex1敲低模型，结合组织特异性Usp2敲低和ML364给药进行体内功能验证，并通过攀爬实验评估运动功能。

**三、研究结果**

**1. USP2药理学抑制或基因敲低恢复PEX1缺陷细胞中过氧化物酶体丰度并改善脂质异常**

在PEX1-G843D患者成纤维细胞中，ML364以剂量依赖方式恢复ABCD3阳性过氧化物酶体斑点，且不影响野生型成纤维细胞的过氧化物酶体数量；在另一独立PEX1突变患者来源细胞系GM16513（携带PEX1 2097insT）中也观察到类似挽救效果。USP2 siRNA敲低同样增加PEX1-G843D细胞中的过氧化物酶体丰度。脂质分析显示，ML364可降低PEX1-G843D细胞中升高的C26:0溶血磷脂酰胆碱（lysoPC）、C24:0 lysoPC水平以及C26:0/C16:0比值。这表明抑制USP2可恢复PEX1缺陷细胞中的过氧化物酶体数量并部分纠正VLCFA相关代谢异常。

**2. USP2抑制抑制病理性过氧化物酶体自噬通量，并通过蛋白酶体途径降低STUB1稳定性**

使用EGFP–mCherry–PEX26TM串联报告系统检测过氧化物酶体自噬通量，发现PEX1-G843D成纤维细胞中“仅红色”斑点显著增加，而ML364处理减少这些斑点并保留双阳性过氧化物酶体，表明USP2抑制可抑制过氧化物酶体向溶酶体的过度递送。机制研究中，在候选E3连接酶中ML364选择性降低STUB1蛋白水平，而不改变PEX2或MARCHF7；蛋白酶体抑制剂MG132可逆转ML364诱导的STUB1降低，说明USP2抑制促进STUB1经蛋白酶体途径降解。PEX1缺陷增强ABCD3泛素化，ML364则显著抑制该泛素化。共免疫沉淀显示USP2与STUB1相互作用，USP2敲低增加STUB1多聚泛素化；STUB1敲低可抑制ABCD3泛素化并挽救PEX1敲低诱导的过氧化物酶体丢失。这些结果共同支持“USP2–STUB1–过氧化物酶体膜蛋白泛素化–病理性过氧化物酶体自噬”的调控轴。

**3. 体内果蝇模型中遗传或药理学靶向Usp2逆转PEX1缺陷相关过氧化物酶体丢失及神经运动障碍**

在果蝇脂肪体特异性Pex1敲低或表达人源化hPEX1-G843D的模型中，过氧化物酶体明显丢失；ML364处理可恢复人源化模型中的过氧化物酶体丰度，而组织特异性Usp2敲低同样产生挽救效果，在体内遗传学上验证了Usp2为靶点介导因子。在神经功能层面，胶质细胞Pex1敲低导致30日龄果蝇腹部腹纵肌神经肌肉接头处轴突肿胀并显著降低攀爬能力；胶质细胞Usp2敲低可减轻轴突肿胀并改善运动能力。该结果表明USP2在体内参与PEX1缺陷相关的神经轴突病理和运动功能障碍。

**四、讨论与结论**

讨论部分指出，PBD-ZSD中基质蛋白导入缺陷仍是首要致病因素，而病理性过氧化物酶体自噬可能进一步加速PEX1相关模型中的过氧化物酶体丢失。与CQ等非选择性晚期自噬抑制剂不同，USP2抑制在更早阶段发挥作用，通过阻断泛素依赖性过氧化物酶体自噬的起始步骤来保留残余的功能性过氧化物酶体。未来研究需要明确USP2–STUB1相互作用的分子细节以及驱动STUB1去稳定化的具体泛素化位点，同时还需进行USP2抑制剂的ADME和药理学优化，并在iPSC来源疾病模型、小鼠模型以及其他PEX基因相关ZSD情境中进一步验证。

研究结论部分可概括为：研究人员将USP2鉴定为PEX1缺陷情境下病理性过氧化物酶体自噬的关键调控因子。在从患者突变成纤维细胞到果蝇的多种模型中，USP2抑制均可恢复过氧化物酶体丰度并减轻疾病相关表型。机制上，USP2通过维持STUB1稳定性促进过氧化物酶体膜蛋白泛素化，从而在PEX1缺失条件下持续驱动异常自噬信号。这些发现表明，USP2是PEX1相关PBD-ZSD的一个可操作靶点，通过选择性调节适应不良性过氧化物酶体自噬而非全局抑制核心自噬，为开发系统层面纠正PEX1缺陷相关细胞功能障碍的治疗策略提供了机制框架。该研究发表于《Signal Transduction and Targeted Therapy》。