乳腺癌相关成纤维细胞外泌体miR-1290经TBC1D4/mTOR通路促进三阴性乳腺癌细胞增殖

《Signal Transduction and Targeted Therapy》：Breast cancer-associated fibroblast-derived exosomal miR-1290 promotes triple-negative breast cancer cell proliferation

　　

乳腺癌是女性癌症相关死亡的主要原因。尽管针对不同亚型特异性受体的治疗策略已用于多种乳腺癌亚型，但三阴性乳腺癌（triple-negative breast cancer，TNBC）仍缺乏有效的靶向治疗。近年来，肿瘤微环境（tumor microenvironment，TME）尤其是癌症相关成纤维细胞（cancer-associated fibroblasts，CAFs）在乳腺癌特别是TNBC进展和转移中的作用日益受到关注。然而，CAFs分泌的外泌体在TNBC细胞增殖中的作用尚不清楚。因此，本研究分析了来自CAFs和MDA-MB-231细胞的外泌体，并鉴定出外泌体miR-1290为关键组分。当外泌体miR-1290被递送至TNBC细胞（BT-549和Hs578T）时，其直接抑制候选肿瘤抑制因子TBC1D4的表达，并伴随TSC1表达降低和mTOR通路激活。通过二维（2D）培养模型、三维（3D）球体模型和体内异种移植模型验证了miR-1290通过直接靶向TBC1D4促进TNBC细胞生长。此外，研究人员证明，mTOR抑制剂雷帕霉素和FDA批准的雷帕霉素类似物依维莫司治疗可有效抑制miR-1290诱导的TNBC细胞增殖，提示这是一种潜在的TNBC治疗策略。此外，在患者队列中，循环miR-1290水平升高可显著区分乳腺癌患者与健康个体，并与较差生存结局相关。因此，miR-1290及其直接靶标TBC1D4在TNBC的靶向治疗和诊断中均具有潜在价值。

乳腺癌是女性癌症相关死亡的主要原因，其治疗因肿瘤内多种细胞类型构成的高度异质性而面临挑战。三阴性乳腺癌（triple-negative breast cancer，TNBC）因缺乏雌激素受体（estrogen receptor，ER）、孕激素受体（progesterone receptor，PR）和人表皮生长因子受体2（human epidermal growth factor receptor 2，HER2）表达，无法从内分泌治疗或HER2靶向治疗中获益，化疗仍是主要选择，但常出现耐药且预后较差。近年出现的免疫检查点抑制剂和PARP抑制剂仅适用于特定分子亚群，仍有许多TNBC患者缺乏广谱靶向治疗。肿瘤微环境（tumor microenvironment，TME）中的癌症相关成纤维细胞（cancer-associated fibroblasts，CAFs）通过分泌外泌体等途径与肿瘤细胞通讯，但乳腺癌相关成纤维细胞（breast cancer-associated fibroblasts，BCAFs）来源外泌体在TNBC增殖中的作用及下游机制尚不明确。已有研究表明外泌体miR-1290在肺癌、乳腺癌脑转移和卵巢癌中介导肿瘤-间质相互作用，但其在TNBC进展中的具体作用仍不清楚。为此，研究人员开展了本研究，并发表于《Signal Transduction and Targeted Therapy》。

主要技术方法：研究人员利用ExoQuick分离BCAF和MB-231细胞外泌体并进行外泌体small RNA-seq；整合GEO（GSE37963、GSE45666、GSE45498、GSE38167、GSE61438、GSE73002）与TCGA公共队列，以及启明大学东山医院TNBC患者血清队列（39例）和组织微阵列（46例）进行验证；采用qRT-PCR、Western blot、免疫细胞化学/组织化学、双荧光素酶报告实验、磷酸化激酶阵列和RNA-seq；在BT-549和Hs578T细胞中开展mimic/siRNA/antagomir转染、2D/3D培养及NOD/Shi-scid/IL-2Rγ_null小鼠异种移植，并给予雷帕霉素或依维莫司。

研究结果：

外泌体miR-1290的鉴定及其临床相关性。通过纳米颗粒追踪分析、透射电镜和Western blot确认了BCAF和MB-231来源外泌体的特征，PKH67标记实验证实其可被TNBC细胞摄取。外泌体RNA-seq显示miR-1290在两类外泌体中均高表达。五个独立GEO数据集的火山图和韦恩图分析显示，miR-1290是乳腺癌/TNBC组织中共同上调的miRNA之一；GSE73002血清数据集及启明大学东山医院独立队列均显示TNBC患者血清外泌体miR-1290水平显著高于正常对照，且高表达与更差的总生存期相关。其他共同上调的miRNA中，仅miR-1290同时具有诊断和预后价值。

BCAF和MB-231来源外泌体及miR-1290促进受体TNBC细胞增殖。BCAF或MB-231来源外泌体处理BT-549和Hs578T细胞后，细胞增殖显著增加，受体细胞中miR-1290水平升高。Transwell共培养实验证实BCAF可通过旁分泌方式向BT-549细胞传递miR-1290并促进增殖。体内实验中，BT-549细胞与BCAF共注射可显著增加肿瘤体积和重量，并提高肿瘤组织中miR-1290及α-SMA、FAP表达。miR-1290 mimic转染在2D培养和异种移植模型中均促进肿瘤生长，并上调增殖标志物Ki67。

miR-1290通过直接靶向TBC1D4促进TNBC细胞增殖。通过RNA-seq与TargetScan预测取交集，共获得12个候选靶基因；TCGA分析显示其中只有TBC1D4在乳腺癌中显著下调，且低表达与较差生存相关。对其他候选基因的siRNA敲低未产生促增殖效应。BCAF/MB-231外泌体或miR-1290 mimic均使TBC1D4的mRNA和蛋白水平下降；双荧光素酶报告实验证实miR-1290直接结合TBC1D4的3'-UTR。siTBC1D4敲低TBC1D4可促进TNBC细胞增殖并上调Ki67。

miR-1290通过下调TBC1D4激活mTORC1信号。TBC1D4敲低未影响GLUT4或GLUT1定位。RNA-seq基因本体分析和磷酸化激酶阵列显示，miR-1290过表达和TBC1D4敲低均增强磷酸化P70S6K（p-P70S6K）水平，提示mTORC1通路激活。RNA-seq显示TSC1表达下降；TCGA及TNBC组织微阵列均显示TBC1D4与TSC1表达呈正相关。功能丧失实验证明，antagomir-1290抑制miR-1290可恢复TBC1D4和TSC1表达，降低p-P70S6K和Ki67水平，并抑制细胞增殖。

雷帕霉素抑制miR-1290诱导的mTORC1信号和细胞增殖。在2D培养和3D球体模型中，mTORC1抑制剂雷帕霉素均可有效抑制miR-1290 mimic诱导的TNBC细胞增殖，减弱p-P70S6K和Ki67的上调。

依维莫司靶向治疗miR-1290诱导的mTOR激活。FDA批准的雷帕霉素类似物依维莫司在2D和3D模型中同样抑制miR-1290诱导的细胞增殖和球体生长，并逆转TBC1D4和TSC1下调及p-P70S6K升高。该药此前主要用于激素受体阳性/HER2阴性乳腺癌，其在TNBC中的应用尚未被深入探索。

依维莫司在异种移植模型中抑制miR-1290诱导的肿瘤生长。在NOD/Shi-scid/IL-2Rγ_null小鼠中，依维莫司口服给药可显著缩小miR-1290 mimic组肿瘤体积和重量；H&E染色显示依维莫司处理组出现广泛肿瘤细胞死亡和坏死区域；免疫组化显示依维莫司有效降低miR-1290诱导的p-P70S6K和Ki67免疫阳性，证实mTORC1信号被阻断。

讨论总结：CAFs是TME中的重要间质细胞，其外泌体介导的通讯在肿瘤生长中发挥关键作用。本研究发现miR-1290同时存在于BCAF和TNBC细胞来源外泌体中，可能形成自分泌/旁分泌正反馈环路。TBC1D4作为miR-1290的直接靶点，其下调不改变GLUT4/GLUT1定位，而是与TSC1表达降低和mTOR激活相关。TBC1D4与TSC1之间的连接目前依据相关性和功能学证据，可能为间接调控，具体中介分子尚待明确。血清外泌体miR-1290可能作为乳腺癌诊断和预后标志物。依维莫司虽然存在多种耐药机制，但高miR-1290可能提示mTOR通路依赖，并可用于筛选可能受益的患者。此外，miR-1290-TBC1D4调控在肾癌、结肠癌和肺癌细胞系中同样存在，提示其具有泛癌种意义。

研究结论：总之，对BCAFs和MB-231细胞分离的外泌体进行RNA-seq分析显示miR-1290水平升高。miR-1290上调导致受体TNBC细胞中TBC1D4表达降低，并伴随TSC1表达下降。miR-1290驱动的TBC1D4抑制伴随mTOR激活，并在2D和3D培养模型中显著增强TNBC细胞增殖。与这些结果一致，用miR-1290 mimic处理的细胞的体内实验显示肿瘤体积增大，表明miR-1290在促进TNBC进展中发挥关键作用。此外，雷帕霉素或依维莫司治疗抑制了miR-1290诱导的mTOR信号激活并有效抑制细胞生长。这些发现揭示了miR-1290在TNBC中的新型致癌功能，并提示miR-1290及其直接靶标TBC1D4可能作为该缺乏有效靶向治疗亚型的有前景的治疗靶点。此外，血清miR-1290水平升高可能是候选诊断生物标志物和潜在的治疗反应预测指标，尽管这些发现基于有限的患者队列，需要在更大规模的独立研究中进一步临床验证。