# 猴痘病毒Clade Ib与Clade IIb在兔模型中的比较致病性研究

《Virulence》：Comparative pathogenicity study of monkeypox virus Clade Ib and Clade IIb in a rabbit model

　　

Mpox已作为一项重大的公共卫生关切出现，随着新变体的出现，其传播已跨越各大洲。来自近期全球爆发的Clade IIb以及新发现的Clade Ib在传播动力学及可能的严重程度上均表现出变化。研究人员通过皮内和静脉联合接种途径，建立了一种新西兰白兔Mpox模型。感染后，兔皮肤出现红斑性丘疹样病变，至第二周进展为结痂和脱痂形成，最终实现愈合和血清转换。对Clade Ib和IIb.A.2.1谱系感染的研究显示，两种猴痘病毒(Monkeypox virus，MPXV)变异株均能引起皮肤和睾丸病变，以及鼻腔、皮肤和睾丸组织的病毒排出。然而，两种变异株在疾病严重程度方面无显著差异。这些发现表明，该兔模型可用于评估针对MPXV的防控措施。

# 兔模型用于MPXV Clade Ib与IIb.A.2.1致病性比较研究解读

## 研究背景与问题

Mpox（猴痘）是由正痘病毒属(Orthopoxvirus)病原体引起的人畜共患疾病，近年来已成为日益重要的全球公共卫生问题。该疾病于1970年在刚果民主共和国首次被发现，此后数十年间主要局限于中非和西非地区，感染主要与接触这些地区感染的啮齿动物有关。然而，2022年Mpox发生全球传播，成为非洲以外报告的最大规模流行，促使世界卫生组织(WHO)于2022年7月23日至2023年5月10日宣布其为国际关注的突发公共卫生事件。与此前通常与疫区旅行史或动物接触相关的感染不同，2022年流行与个体间的性接触相关。2024年，中非和东非报告的Mpox病例再次增加，WHO于2024年8月14日第二次宣布国际关注的突发公共卫生事件。

系统发育学上，病毒分为两个不同的分支(clade)：Clade I（中非或刚果盆地分支）和Clade II（西非分支）。2022年前报告的Mpox疫情平均病死率(CFR)，Clade I为10.6%，Clade II低于4%。2022年病毒全球传播后，猴痘病毒(Monkeypox virus，MPXV)的加速微进化被观察到，导致分支进一步细分为亚分支(Ia， Ib， IIa， IIb)和谱系(A， B， C)。2022至2023年全球Mpox病例激增主要与Clade IIb MPXV相关，而Clade Ib则主要在2024年中非和东非感染激增期间报告。Clade IIb.B.1变异株是2022年流行期间报告的主要谱系，Clade IIb.C.1从2023年年中起成为重要变异株，Clade IIb.A.2谱系在美国、英国、印度和泰国也有报告。这些变异株基因组中出现了多种核苷酸替换和缺失，但其对基因功能的影响尚不清楚。特别是A.2变异株中观察到独特的核苷酸变化，表明其独立出现。该变异株中鉴定出OPG174基因（一个影响毒力的基因）的七核苷酸缺失。OPG174已知可抑制宿主免疫应答，其突变可能改变毒力，并可作为治疗干预的潜在靶点。

动物模型是研究病毒特性以及评估疫苗或治疗方法的重要工具。多种动物模型如实验室小鼠品系、豚鼠、睡鼠、兔、草原犬鼠、松鼠和非人灵长类模型已被研究用于MPXV易感性评估。这些模型对感染表现出不同程度的易感性，但并非所有人类Mpox疾病的临床特征都能被重现。野生啮齿动物如地松鼠、草原犬鼠、睡鼠和Cast/EiJ小鼠高度易感，但难以在世界各地获得用于研究；非人灵长类模型相对昂贵且不易获得；兔类价格较低且更易操作，已被用作兔痘和痘苗病毒等其他痘病毒的动物模型，但其与人类的免疫学和解剖学差异是一个缺点。此前两项研究已证实兔对MPXV的易感性，分别使用1976年Copenhagen株（Clade I）和Clade IIb C.1.1变异株。然而，已有动物模型研究大多使用历史分离株，针对近期分离株的研究仅限于少数几项。因此，利用更新的病毒分离株建立合适的动物模型，对于理解病毒进化后的致病性和传播动态、评估干预措施的有效性具有重要意义。

## 研究人员开展的研究与结论

为比较2022至2023年流行期间分离的MPXV Clade Ib和Clade IIb.A.2.1病毒在兔模型中引起的疾病，研究人员开发了一种结合皮内(intradermal)和静脉(intravenous)两种途径接种的新西兰白兔(New Zealand White rabbit)模型。通过此模型，研究人员首先验证了兔对MPXV的易感性，进而对两种病毒变异株的致病性进行了平行比较。研究结果显示，两种变异株均能在兔中引起皮肤和睾丸病变，经鼻腔、皮肤和睾丸组织排毒，并能诱导特异性抗体应答。然而，两种变异株在疾病严重程度上未观察到显著差异。该研究建立了一个可用于评估针对MPXV的医疗对策的兔模型，为后续疫苗和治疗方法的评价提供了实用工具。

## 主要关键技术方法

研究人员使用了以下主要技术方法开展研究：病毒分离与生长动力学分析，在Vero（ATCC? CCL-81?）细胞上进行病毒培养、滴定（按Reed和Muench法计算半数组织培养感染量TCID₅₀），并通过全基因组测序对病毒分离株进行序列验证。动物实验经ICMR-National Institute of Virology (ICMR-NIV)， Pune机构动物伦理委员会批准，遵循印度政府CCSEA指南，在ABSL-4最高防护设施中进行；使用3至4月龄亚成年新西兰白兔，通过皮内和皮内-静脉联合途径接种，设置健康对照组。病毒载量通过实时定量PCR(qPCR)检测，利用B6R包膜蛋白基因引物扩增病毒DNA（样本包括拭子、皮肤结痂和组织匀浆）。病毒分离与感染性评估通过在Vero细胞上培养临床样本并观察细胞病变效应(CPE)。抗MPXV兔IgG抗体检测使用γ射线灭活MPXV抗原包被的酶联免疫吸附试验(ELISA)。组织病理学和免疫组织化学评估对福尔马林固定的皮肤和睾丸组织进行苏木精-伊红(H&E)染色，使用抗MPXV小鼠多克隆血清进行免疫组化染色(DAB显色)。

## 研究结果

**皮内接种与皮内-静脉联合接种的疾病比较：** 在初始实验中，8只兔经皮内途径感染，4只兔经皮内-静脉联合途径感染MPXV Clade IIb.A.2.1变异株。结果显示，皮内组8只中3只出现皮肤病变，而联合组4只全部表现皮肤病变。皮肤病变在感染后约4至5天出现，初为红斑隆起区域，发展为深红色丘疹，于第9至10天形成结痂；痂皮通常在2至3周内脱落，病变在3周末完全消退。病变数量存在个体差异，大小不一。经皮内途径感染的兔中，2/8的口腔和直肠拭子检测到MPXV DNA，3/8的鼻拭子阳性；经联合途径感染的兔中，2只口腔拭子、1只直肠拭子及全部4只鼻拭子均检出MPXV DNA。至感染后第21天，所有感染兔均产生了抗MPXV IgG抗体，皮内组滴度范围为6400至25600，联合组范围为6400至12800。皮肤结痂样本中也检出MPXV DNA。联合接种途径在诱导皮肤病变方面更为有效，因此被选作用Clade Ib和IIb.A.2.1比较研究的感染方式。

**Clade Ib与Clade IIb.A.2.1病毒的疾病比较：** 在第二项实验中，分别用Clade Ib和Clade IIb.A.2.1分离株（各5只雄性兔）经皮内-静脉联合途径感染。两组兔在14天研究期间均表现正常食欲和活动，无明显体重下降。两组在第一周均出现轻微（非显著性）平均直肠温度升高。至感染后第14天，两组均检出抗MPXV IgG抗体，Clade Ib组终点滴度范围为400至1600，Clade IIb.A.2.1组为6400至12800，后者显著高于前者。皮疹约在感染后第5天开始出现，表现为不同大小的红斑隆起区域，部分发展为深红色丘疹并形成结痂。Clade IIb.A.2.1感染兔表现出15至50多个病灶，Clade Ib感染兔为4至25个病灶。在一只Clade IIb.A.2.1感染兔中观察到阴囊皮肤弥漫性病变，并发展为结痂和痂皮形成。

**病毒脱落与器官嗜性：** MPXV DNA仅在感染后第8和10天于两组各2/5兔的口腔拭子中检出；而鼻拭子中的病毒DNA从第4天即可检出并持续至第14天，在第8和10天时所有兔鼻拭子均为阳性。从第8天的鼻拭子样本（PCR循环阈值(Ct)范围21至34）和皮肤结痂样本（Ct范围17至36）中成功分离出病毒。第14天收集的睾丸样本中，Clade Ib组4/5和Clade IIb.A.2.1组4/5检测到病毒DNA，并成功分离出病毒。此外，Clade Ib和IIb.A.2.1组各有1只兔肺样本、Clade Ib组3只兔肝和脾样本检出病毒DNA，但未能分离到病毒；淋巴结样本均为阴性。

**组织病理学和免疫组织化学：** 皮肤样本组织病理学检查显示真皮内大量炎性细胞浸润及表皮结痂形成；结痂由坏死角质形成细胞、中性粒细胞和红细胞组成。在皮内接种部位观察到显著的炎性细胞浸润。免疫组化染色显示皮肤结痂和表皮细胞呈阳性。睾丸组织学检查显示，Clade Ib组4/5和Clade IIb.A.2.1组3/5兔出现不同程度的生精上皮和精母细胞丢失；2只Clade IIb.A.2.1感染兔睾丸组织形态正常。免疫组化在MPXV PCR阳性兔的曲细精管精原细胞和精母细胞中观察到阳性染色。肺和肝脏组织未见组织学改变。

## 讨论与结论

研究人员在讨论中指出，该兔模型通过皮内-静脉联合接种方式成功模拟了人类Mpox的多种临床特征，包括皮肤丘疹、结痂和血清转换。人类Mpox以发热、皮疹和淋巴结肿大为特征，生殖器周围皮肤是病变主要部位之一；研究人员在部分感染兔中出现皮肤病变并向结痂发展，但未观察到脓疱阶段。MPXV可从兔的鼻拭子、皮肤结痂和睾丸组织中分离到，这与人类感染中皮肤病变和上呼吸道排毒的观察相一致。MPXV抗原在睾丸精母细胞中的定位与该病毒在非人灵长类模型中间质细胞和曲细精管中的抗原检测结果相符。

不同接种途径的比较显示，单独皮内注射组表现出更高的IgG应答，但皮肤病变和病毒脱落的兔数量少于联合接种组，提示皮内途径可能诱导更快的免疫应答，而静脉途径可能使病毒绕过宿主免疫防御，从而利于疾病发展。既往研究曾表明成年兔对MPXV易感性存在差异，年幼兔更易感且常导致致死性疾病，而成年兔易感性相对较低；在成年兔中，既往仅报告静脉接种途径可导致皮疹。在本研究中，亚成年兔（3至4月龄）经皮内途径感染有3/8出现全身性皮肤病变，与早期研究结果不同，这可能与兔的年龄、病毒剂量和毒株差异有关。

值得注意的是，既往在致死性Cast/EiJ小鼠模型中，Clade I病毒较Clade II毒力更强；近期研究在Cast/EiJ小鼠中也报道Clade Ib较Clade IIb毒力增加。然而，在兔模型中，研究人员未发现Clade Ib和Clade IIb.A.2.1变异株在疾病表现或毒力方面存在差异。这一结果提示该模型在区分不同病毒株致病性方面的能力可能需要进一步评估。研究存在一定局限性，如样本量较小、基于单一时间点评估器官病理和病毒嗜性等；未来需要更大样本量研究、多时间点的病毒载量和病理动态评估，以及纳入更多当代分离株来验证该模型的适用性。

综上，研究人员成功建立了一个Mpox疾病兔模型，该模型对MPXV Clade Ib和Clade IIb.A.2.1变异株均表现出易感性。在兔模型中比较两种变异株时，未发现Mpox疾病体征、病毒脱落或器官嗜性方面的显著差异。该模型的建立为评估针对MPXV的医疗对策（包括疫苗和治疗药物）提供了有价值的工具。