慢性循环热应激对肉鸡胸肌蛋白质组学的影响

《British Poultry Science》：Impact of chronic cyclic heat stress on breast muscle proteomics in broiler chicken

　　

1.前期研究表明，与热中性（TN；23°C）组相比，慢性循环热应激（HS；33°C，8小时/天）导致肉鸡胸肌重量减少18.2%。鉴于热应激对肉鸡胸肌重量的不利影响，本试验采用基于质谱（MS）的蛋白质组学技术，比较了在HS或TN条件下饲养的肉鸡肌肉蛋白表达差异，旨在探究热应激诱导胸肌重量减少的分子机制。 2.试验在肉鸡15–35日龄期间进行。驯化期为第15至第21天，HS组肉鸡暴露于从28°C逐步升高至33°C（8小时/天）的温度环境中，至第21天达到33°C并维持至第35天。 3.第35天，随机选取雄性肉鸡（每组n = 10只；总n = 20只）实施安乐死，用于胸肌蛋白质组分析。蛋白质组学分析采用栏级生物学重复（每组n = 4），以鉴定响应慢性循环热应激的差异丰度蛋白。采用液相色谱-串联质谱（LC-MS/MS）结合生物信息学分析，鉴定胸肌中响应热应激暴露而丰度发生显著变化的蛋白质。 4.生物信息学分析确认116个差异表达蛋白，其中大多数（88%）在热应激条件下表达下调（以显著融合评分≤0.05为判定标准）。与细胞外基质组织和结构完整性相关的KEGG通路显著富集，包括肌细胞细胞骨架、细胞外基质（ECM）-受体相互作用和黏着斑通路。这些通路中的大多数相关蛋白在热应激肉鸡胸肌中表达下调。 5.基因本体论（GO）细胞组分条目中，包括细胞外基质和外部封装结构等条目显著富集，可能表明热应激诱导肉鸡胸肌结构稳定性和细胞-基质相互作用受损。

论文解读

一、研究背景与目的

肉鸡是全球粮食安全的重要组成部分，约占肉类总产量的39%。随着消费者对高品质、低脂且经济实惠的肉类需求不断增长，肉鸡产业预计将进一步扩张。为满足日益增长的需求，遗传选育已培育出生长速度快、饲料转化率高、加工日龄胸肌产量更高的肉鸡品种。然而，这些遗传增益伴随着代谢率升高，产生大量内源性热量，而鸡缺乏高效的散热机制——没有汗腺，且被厚密的羽毛覆盖，散热能力进一步受限。随着气候变化导致炎热季节频率和强度增加，慢性热应激被认为是家禽生产中面临的主要障碍，制约着生产性能、动物福利和经济效益的发挥。

前期研究已证实，与热中性条件（23°C）相比，慢性循环热应激（33°C，8小时/天）显著降低了肉鸡的生长性能和胸肌重量（约减少18%），并伴随肠道形态受损和生理稳态紊乱。传统观点认为热应激导致的生产性能损失主要归因于采食量下降，但现有证据表明高温直接损害肌肉生物学功能。长时间暴露于高温环境会导致肌肉结构退化和蛋白质表达改变，这与肌肉重量损失密切相关。这些效应可能通过干扰肌生成过程介导，特别是抑制成肌细胞增殖和分化。现代快速生长型肉鸡的胸肌对热应激高度敏感，因其与胸肌循环供血减少有关，可能抑制卫星细胞介导的肌纤维再生。

尽管前期研究已表征了慢性循环热应激对肉鸡生产性能和胸肌重量的不利影响，但其潜在的分子驱动机制仍不清楚。转录组学分析已显示热应激下调编码细胞骨架组织和肌肉组织完整性所必需的结构蛋白基因，但蛋白质是基因的主要功能产物，仅凭转录组数据不足以完全揭示基因的生物学功能。因此，本研究旨在利用蛋白质组学技术定量胸肌组织中蛋白质丰度的表达变化，并鉴定参与胸肌重量减少的分子机制。

二、研究设计与技术方法

研究人员在墨尔本大学开展了动物试验，试验方案经该校动物伦理委员会批准（项目编号30 829）。试验使用Ross 308商品肉鸡，1日龄雏鸡从商业孵化场获取，1–14日龄饲喂商品开食料。第15天，128只肉鸡按每栏8只分配到地面栏中，饲养于两个环境控制室，分别为热中性（23°C）或慢性循环热应激（33°C，8小时/天，第22–35天）。第15至21天为驯化期，HS室温度从28°C逐步升至33°C。第35天，随机选取雄性肉鸡（每组10只，共20只）实施安乐死，采集胸肌（胸大肌前部区域）样本，液氮速冻后保存于?80°C。

蛋白质组学分析采用以下关键技术流程：蛋白质提取采用含5% SDS的裂解缓冲液，经超声破碎和匀浆处理后，使用Pierce BCA蛋白定量试剂盒进行蛋白定量；蛋白消化采用S-Trap微柱方案，以胰蛋白酶（酶与蛋白比1:20）于37°C过夜酶解；LC-MS/MS分析采用Orbitrap Exploris 480质谱仪（赛默飞世尔）偶联UltiMate 3000液相色谱系统，采用数据非依赖采集（DIA）模式，设置50个13.7 Da窗口；数据处理使用DIA-NN（版本2.3.0）软件，以鸡（Gallus gallus）参考蛋白质组（UniProt知识库，2025年9月22日下载）为搜索数据库，肽段和蛋白质鉴定采用1%假发现率阈值；生物信息学分析使用Perseus（版本2.1.6.0）、RStudio（版本4.5.1）和Microsoft Excel，以栏为实验单位（每组4个生物学重复），差异蛋白分析采用Limma包的经验贝叶斯调节t检验，差异表达蛋白以融合评分（π-score）≤0.05为判定标准；功能富集分析使用ShinyGO v0.85.1平台，以鸡为参考物种，采用KEGG通路和GO注释数据库，FDR截断值为0.05。

三、研究结果

蛋白质组整体差异分析。 主成分分析（PCA）显示，HS组和TN组在PC1（30.1%方差）和PC2（16.8%方差）上形成两个部分分离的聚类。共鉴定出2,291个蛋白质，其中116个为差异表达蛋白（融合评分≤0.05），包括14个上调蛋白和102个下调蛋白，即88%的差异表达蛋白在热应激条件下表达下调。这一结果与已发表的转录组学研究一致——热应激条件下肉鸡胸肌中大多数差异表达基因呈下调趋势。

KEGG通路富集分析。 功能富集分析鉴定出三条显著富集的KEGG通路：ECM-受体相互作用（gga04512）、肌细胞细胞骨架（gga04820）和黏着斑（gga04510）通路，分别涉及7个、18个和11个差异表达蛋白。这些通路中大多数蛋白在热应激肉鸡胸肌中表达下调，唯一例外是肌球蛋白重链15（MYH15）呈上调表达。MYH15的上调提示热应激可能激活了与生长相关肌病中类似的再生通路，但需谨慎解读——MYH15表达与纤维化相关基因存在正相关，而本研究中纤连蛋白（FN1）在热应激组中表达下调，不支持热应激激活肌肉纤维化进程。

ECM-受体相互作用通路。 该通路中，I型胶原蛋白α1链（COL1A1）和α2链（COL1A2）在热应激组中均表达下调。I型胶原是结缔组织中最主要的纤维状胶原，为组织提供弹性和机械强度。III型胶原（COL3A1）同样表达下调。研究人员指出，I型和III型胶原的同步下调不支持肌肉纤维化的激活——纤维化以结缔组织过度沉积和受损纤维替代为特征——而是提示纤维状胶原合成受到抑制，这可能导致肌肉组织完整性受损，构成热应激条件下胸肌重量减少的机制之一。

肌细胞细胞骨架通路。 该通路中多个关键蛋白表达下调。锚蛋白重复结构域蛋白1（ANKRD1）在热应激下表达降低，该蛋白是肌细胞稳态的介导因子，被认为是肿瘤坏死因子α（TNFα）驱动炎症信号的负调控因子，其下调可能使炎症信号短暂放大，参与肌肉组织的适应性重塑。肌连蛋白2（MYOZ2）属肌节蛋白家族，参与肌细胞分化、生长和稳态调控，其下调与胸肌产量和体重减少相关。Na?/K?-ATP酶亚基β-3（ATP1B3）表达下调，提示热应激损害离子泵功能。富含半胱氨酸和甘氨酸蛋白1（CSRP1）表达下调（log₂倍数变化 = 1.27 ± 0.30），该蛋白在细胞质中参与肌动蛋白丝成束和细胞骨架完整性维持，在细胞核中作为转录共因子参与肌分化。四个半LIM结构域蛋白1（FHL1）表达下调，该蛋白在骨骼肌中高表达，参与肌原纤维组装、促进成肌细胞融合和肌管增大。研究人员指出，急性热应激可能触发短暂的适应性反应，而慢性热应激最终使肌肉反应转向抑制状态，破坏肌肉发育所需的结构和信号框架。

黏着斑通路。 该通路中多个蛋白表达下调，包括胶原α链蛋白（COL1A2、COL6A3）和腱生蛋白（tenascin）。腱生蛋白是机械调控的基质细胞蛋白，在机械应激期间协调肌肉修复并维持快肌纤维完整性，其下调提示热应激肉鸡胸肌结构稳定性受损、有效响应损伤的能力下降。

GO细胞组分富集分析。 GO富集分析仅在细胞组分类别中发现显著富集条目，包括外部封装结构（GO:0030312）和细胞外基质（GO:0031012）。转化生长因子-β诱导蛋白ig-h3（TGFBI）参与这些通路，该蛋白调控细胞黏附、细胞运动和組織发育，并在维持再生平衡中发挥作用——促进肌生成并减少纤维化。其下调提示热应激条件下ECM对肌源性分化和融合的支持受损，再生能力下降。

其他重要发现。 碳酸酐酶3（CA3A）虽不属富集通路蛋白，但在热应激组中显著下调（log₂倍数变化 = 2.54 ± 0.57）。该酶是骨骼肌中重要的胞质酶，催化CO₂的可逆水合反应，参与维持代谢稳态。CA3缺失与线粒体ATP合成受损相关，而热应激已知会损害线粒体功能并破坏氧化还原稳态。

四、讨论与结论

讨论部分总结。 研究人员指出，本研究存在以下局限性：蛋白质组学分析仅使用雄性肉鸡，研究结果不能推广至雌性；实验设计无法区分采食量减少和热应激直接细胞毒性对蛋白质组变化的相对贡献。尽管伴随研究记录了慢性循环热应激下采食量降低，但该参数在栏级混合性别群体中测量，而蛋白质组学分析针对个体雄性肉鸡，无法准确估算个体采食量，因此无法稳健评估营养摄入与蛋白质丰度之间的关系。

研究结论。 在蛋白质组水平上，慢性循环热应激导致肉鸡胸肌中大量蛋白质表达下调，这些蛋白质可能参与维持肌肉结构、组织完整性、生长和修复。这些发现加深了对快速生长型肉鸡在长期循环热应激下肌肉蛋白表达响应的理解，并突显了热应激对肌肉结构完整性的主要影响，为热应激导致胸肌重量减少（伴随体重降低）提供了分子证据。