二烯延伸查尔酮通过FA1结合实现人血清白蛋白的红色荧光检测

《Biosensors》：Diene-Extended Chalcones Enable Red Fluorescence Detection of Human Serum Albumin Through FA1 Binding

　　

荧光分子探针用于尿液和血液中人血清白蛋白（human serum albumin, HSA）蛋白的选择性和实时检测，在多种疾病的临床诊断中具有重要应用。大多数已知荧光HSA探针的发射位于蓝-绿光谱区，该区域的生物自发荧光可能干扰检测。在本研究中，一系列具有延伸共轭的查尔酮被证明可产生红色发射，并具有大斯托克斯位移（Stokes shift）（λ_abs ≈ 430–445 nm，λ_em ≈ 620–640 nm），且在H₂O中荧光较低。加入HSA蛋白后，这些查尔酮的荧光显著增强，最高可达30倍。通过使用多种已知位点选择性药物的竞争置换实验，研究人员考察了与HSA的潜在位点选择性结合。结合分子对接实验，研究进一步表明这些查尔酮可选择性地进入FA1（脂肪酸位点1，Fatty Acid site 1）结合口袋（药物位点III）。

人血清白蛋白（human serum albumin, HSA）是血浆中含量最丰富的蛋白质，维持渗透压并运输内源性代谢物、脂肪酸、激素和多种药物。HSA浓度异常与肝功能障碍、肾病、营养不良、心血管疾病和系统性炎症密切相关，因此发展快速、选择性高的HSA定量方法在临床诊断和即时检测中具有重要意义。荧光检测具有灵敏度高、时间分辨率好、操作简单、适合小型化设备等优点，但已有HSA荧光探针多发射蓝绿光，易受生物自发荧光干扰；同时部分探针位点选择性有限、对蛋白识别机制的了解不足。为此，研究人员以一组π延伸二烯共轭查尔酮为骨架，系统考察甲氧基取代对HSA识别与荧光激活的影响，并明确其结合位点与调控机制。

研究人员研究了六个二烯延伸查尔酮1a–1f。在水和PBS中，这些探针呈现弱荧光；加入HSA后，吸收谱带变窄，荧光显著增强，最大增强为1a的31倍。荧光滴定与Hill方程拟合表明，甲氧基取代影响表观结合常数：1a K=2.54 μM，1b 2.04 μM，1c 1.55 μM，1d 1.77 μM，而1e、1f分别为5.44和4.45 μM。所有探针的检测限处于纳摩尔水平，1b最低为11 nM。时间依赖实验显示，含邻位甲氧基的衍生物能较快稳定蛋白结合态。竞争置换实验和分子对接共同表明，探针结合于非经典FA1/血红素位点（药物位点III）。远端Sudlow位点配体可诱导变构效应，调节结合态探针的荧光输出。该研究将二烯延伸查尔酮确立为灵敏、可调的HSA荧光传感平台，并提出FA1靶向传感器设计策略。

本研究采用紫外-可见吸收光谱、荧光光谱和绝对荧光量子产率测定表征探针光物理性质；通过荧光滴定结合Hill方程拟合提取表观结合参数；使用华法林、布洛芬、甲基橙和血红素进行竞争置换实验判断结合位点；采用AutoDock 4.2.6对HSA晶体结构（PDB ID: 1AO6）进行全局分子对接，并用PyMol和ChimeraX分析结合构象。研究未涉及临床样本队列。

3.1 传感器设计
该系列基于前期报道的π延伸供体-受体查尔酮，通过甲氧基取代调节分子内电荷转移（intramolecular charge transfer, ICT），同时保持共同分子骨架。前期光谱、晶体和计算研究已表明取代方式可改变骨架平面性、激发态弛豫和荧光效率，因此该系列适合考察微小结构变化对HSA识别和荧光激活的影响。

3.2 HSA敏感性
在PBS中，多数衍生物吸收带变宽并出现红移尾峰，浓度依赖吸收实验提示形成J型聚集态。加入HSA后，吸收峰变窄，荧光显著增强，1a增强约31倍；量子产率为0.080–0.334，1d最高。Hill拟合显示1a近似双曲线（n=1.00），1b–1d的Hill系数为1.48–1.55。分析灵敏度方面，所有探针初始范围线性良好（R²=0.987–0.998），检测限（limit of detection,