银(I)硫代水杨酸衍生物配合物：兼具抗菌、抗生物膜与免疫调节活性的新型多功能候选药物

《Pharmaceutics》：Silver(I) Complexes with Thiosalicylic Acid Derivatives as Promising Antimicrobial, Antibiofilm, and Immunomodulatory Agents

　　

背景/目的： 银因其多样化的药理效应在医学领域应用历史悠久。将银离子与硫代水杨酸（thiosalicylic acid，TSA）衍生物等生物活性配体配位，可合成具有潜在抗菌和抗肿瘤活性的新型配合物。方法： 采用基于刃天青（resazurin）的微量稀释法测定了银(I)配合物（C1–C5）及其相应配体（L1–L5）的体外抗菌活性，并评估了其对金黄色葡萄球菌（S. aureus）、奇异变形杆菌（P. mirabilis）和铜绿假单胞菌（P. aeruginosa）预成生物膜的抑制效果。为探究所研究银(I)配合物的结合模式与亲和力，针对LasR转录调节因子开展了分子对接研究，同时利用pkCSM在线平台进行了计算机模拟ADMET筛选。最后，通过检测细胞因子浓度并进行流式细胞术分析，评估了银(I)配合物的体外免疫调节效应。结果： 体外与计算机模拟评估均证实，C2配合物具备大小与疏水性之间的最优结构平衡，从而对铜绿假单胞菌（P. aeruginosa）表现出优异的抗菌和抗生物膜活性。在免疫应答方面，经脂多糖（LPS）刺激后，C3配合物处理可降低促炎细胞因子IL-1β、TNF-α、IL-6和IL-12的浓度，同时升高抗炎细胞因子IL-10的浓度。结论： 研究结果表明，C2主要靶向细菌病原体，而C3则发挥显著的免疫调节和抗炎效应，且其对固有免疫与适应性免疫细胞、未致敏与致敏状态细胞的作用存在差异。因此，探究C2与C3的联合或序贯应用，可能为慢性生物膜相关感染的治疗提供一种有前景的策略。

一、研究背景与意义

银在医学中的应用可追溯至古代，希波克拉底即已认识到银制剂的治疗价值，用于处理溃疡和化脓性伤口以预防感染并促进组织再生。19世纪，银缝合线和银导尿管显著降低了手术感染率和尿路感染风险。20世纪中期抗生素的普及使银制剂的应用一度缩减，然而抗生素的滥用导致耐药菌株急剧增加，现代医学重新将目光投向银基化合物。目前全球最著名的银制剂磺胺嘧啶银仍是严重烧伤感染治疗的关键药物。临床数据显示，低剂量银的使用不会引发铂族金属特有的严重全身毒性，但长期暴露可能导致银在器官中蓄积，引发银质沉着病、白细胞减少和肝损伤。与其它过渡金属离子相比，银相对良好的安全性推动了以银(I)离子为中心金属的新型配位化合物研发。

硫代水杨酸（TSA）及其衍生物具有广泛的药理和工业应用。研究表明，硫代水杨酸盐能抑制胸腺间质钙升高，并抑制硫柳汞诱导的血管内皮生长因子释放。TSA衍生物法尼基硫代水杨酸作为法尼基半胱氨酸的合成模拟物，在转化癌细胞中表现出强效的Ras蛋白信号抑制活性。TSA衍生物结构中"硬"与"软"供体原子的独特组合赋予其高度多样化的配位潜力。

银仅在离子化状态或配位化合物形式下发挥抗菌作用。近年研究强调银与非甾体抗炎药配位化合物的意义，其中银-尼美舒利配合物通过银与巯基相互作用调节免疫应答，抑制环氧合酶-2并降低TNF-α和IL-1β水平，在治疗感染和炎症方面发挥协同效应。生物膜基质保护微生物免受宿主免疫应答和抗菌药物攻击，促进持续性感染并显著增加治疗难度，同时生物膜还促进慢性炎症、白细胞浸润增加、组织损伤和伤口愈合延迟。因此，能够同时抑制浮游菌生长、阻止生物膜形成并调节过度炎症反应的新型银(I)配合物代表了一种有前景的治疗策略。作为前期研究证明新型银(I)硫代水杨酸衍生物配合物具有广泛抗肿瘤活性的延续，本研究通过引入不同脂肪族和芳香族部分进行系统性结构修饰，建立此前缺乏的银配合物构效关系，评估其更广泛的治疗潜力。

二、研究设计与关键方法

研究人员合成了S-烷基TSA衍生物配体（L1–L5）及其银(I)配合物（C1–C5）。体外抗菌活性采用基于刃天青的微量稀释法测定，针对10种微生物（5株参考菌株和4株临床分离株及1株真菌），临床分离株由克拉古耶瓦茨公共卫生研究所提供。抗生物膜活性针对金黄色葡萄球菌ATCC 25923、奇异变形杆菌ATCC 12453和铜绿假单胞菌ATCC 27853的预成生物膜进行评估。分子对接研究使用AutoDock 4.2软件针对LasR转录调节因子（PDB ID: 2UV0）进行，配合物几何结构采用ORCA 6.1.1程序包在B3LYP-D3(BJ)泛函水平下进行DFT优化。计算机模拟ADMET筛选使用pkCSM在线平台。体外免疫调节效应通过ELISA检测细胞因子浓度和流式细胞术评估，脾细胞分离自BALB/c小鼠脾脏。

三、主要研究结果

3.1 配体与银(I)配合物的抗菌活性

游离配体L1–L5总体表现出弱或无抗菌活性，MIC和MMC值大多超过500 μg/mL。相比之下，银配合物C1–C5对所有测试微生物表现出显著增强的抗菌活性，细菌MIC范围为3.9至62.5 μg/mL，其中对铜绿假单胞菌ATCC 27853的最低MIC为3.9 μg/mL（C1–C4），对大肠杆菌ATCC 25922的MIC为7.8 μg/mL（C2）。C5为最活跃化合物，对金黄色葡萄球菌ATCC 25923和奇异变形杆菌ATCC 12453的MIC低至7.8 μg/mL。配合物对革兰氏阳性菌的MIC值普遍高于革兰氏阴性菌，这可能反映细菌细胞包膜的结构差异。对白色念珠菌的MIC范围为31.25至250 μg/mL。研究表明配位作用对生物活性至关重要，银配位不仅稳定Ag(I)离子，还通过调节理化性质改善抗菌效力。

3.2 预成细菌生物膜的抑制

生物膜定量结果显示铜绿假单胞菌ATCC 27853、奇异变形杆菌ATCC 12453和金黄色葡萄球菌ATCC 25923均能形成良好生物膜。所有配合物在测试浓度范围内均未实现90%生物膜生物量减少。C2对铜绿假单胞菌ATCC 27853表现出最低BIC₅₀值（75 μg/mL），显示更强的抗生物膜潜力；C1对金黄色葡萄球菌ATCC 25923的BIC₅₀为128 μg/mL；C3对奇异变形杆菌ATCC 12453的BIC₅₀为332 μg/mL；C5未表现出显著抗生物膜活性。研究显示菌株依赖性响应，铜绿假单胞菌生物膜最为敏感。与多数研究聚焦抑制生物膜早期形成不同，本研究评估了配合物对成熟生物膜的作用，虽未实现完全根除，但观察到的成熟生物膜生物量减少证明配合物在生物膜成熟后仍保留活性。

3.3 优化分子结构与量子化学结果

优化几何结构分析显示Ag-Ag距离范围为2.7970至3.1276 ?，C1最短，C2最长。Ag-O键长在2.1245至2.3540 ?范围内。C1、C3和C4的Ag-O距离范围较窄，表明两个银中心周围配位环境相对相似，而C2和C5的个别Ag-O距离差异较大。优化结构保留了特征性双核银排列，Ag-O配位相互作用在整个系列中保持。

3.4 分子对接研究

分子对接验证RMSD值为0.899 ?，成功验证对接方案。所有测试化合物均显示有利的结合亲和力，C2配合物结合自由能最低（?10.34 kcal/mol），C5也显示较高结合亲和力（?9.22 kcal/mol）。C1通过TSA配体的羧基氧和硫原子与Thr75形成两个常规氢键，Trp88和Phe101参与π-π堆积和π-π T型相互作用。C2除保留类似相互作用模式外，TSA硫原子孤对电子与Thr115形成额外氢键，Tyr64参与π-π堆积。C3的羰基氧孤对电子与Ser129形成氢键，疏水相互作用网络包括Tyr56、Trp60、Tyr64、Val76、Leu125和Ala105。C5的庞大结构含多个芳香环增加刚性，可能阻止其在LasR活性位点采取有利取向。C2配合物（TSA乙基衍生物）在体外试验和分子对接中均表现出对铜绿假单胞菌的最高抗菌效力，突出了LasR结合口袋内亲脂性与空间需求之间的关键平衡。

3.5 计算机模拟ADMET谱

所有测试配体的预测吸收百分比超过92%，提示高人体肠道吸收率。除L4外，所有配体均非P-gp底物。血脑屏障通透性logBB值在0.004至0.146之间，表明中等屏障穿越和中枢神经系统渗透。配体对CYP3A4、CYP2D6和CYP2C9代谢酶无亲和力，有利于避免不良代谢清除和药物相互作用。Ames致突变性预测表明测试配体缺乏致突变潜力，所有配体均被预测为hERG I和hERG II非抑制剂，显示良好的理论心脏毒性谱。

3.6 C3配合物的体外免疫调节效应

C3配合物处理显著降低TNF-α和IL-12浓度。C3与LPS共处理后，IL-1β、TNF-α、IL-6和IL-12浓度较LPS处理组显著降低，IL-10浓度显著升高。流式细胞术分析确认了这些发现：C3与LPS共处理显著降低IL-1β⁺、TNF-α⁺和IL-12⁺ F4/80⁺巨噬细胞百分比，而IL-10⁺ F4/80巨噬细胞百分比升高。C3处理增加CD206⁺ F4/80⁺巨噬细胞百分比。在ConA刺激条件下，C3与ConA共处理显著降低IL-1β和IL-17浓度。流式细胞术显示C3与ConA共处理显著降低CD69⁺、TNF-α⁺和IL-17⁺ CD3⁺脾细胞百分比，并增加IL-10⁺CD3⁺脾细胞百分比。这些发现表明C3的免疫调节效应可能取决于巨噬细胞和T细胞的活化状态，在基础条件下增加IL-1β⁺CD3⁺脾细胞百分比，而在ConA刺激条件下减弱T细胞活化和促炎反应。

四、讨论与结论

本研究证明所研究的银(I)配合物具有独特且互补的生物学活性。体外和计算机模拟分析均确定C2配合物是对铜绿假单胞菌最有效的抗菌和抗生物膜剂，其有利活性与分子大小和疏水性的最佳平衡相关，分子对接提示与LasR群体感应调节因子的潜在相互作用可能促成观察到的抗菌效应。C3配合物可能具有免疫调节效应，其对巨噬细胞和T细胞在基础和刺激条件下的作用不同，同时减弱LPS/ConA诱导的促炎反应。未来研究应评估这些配合物的稳定性、药代动力学、生物相容性和体内治疗效力，以进一步明确其转化潜力。此外，探究C2和C3的联合或序贯应用可能为慢性生物膜相关感染的治疗提供有前景的策略，因为在这些感染中同时实现细菌根除和过度炎症调节对成功治疗至关重要。