海洋鱼类源血管紧张素转化酶抑制肽：酶解制备及其体外活性研究

《Marine Drugs》：Marine Fish-Derived ACE-Inhibitory Peptides: Preparation via Enzymatic Hydrolysis and Their In Vitro Activity

　　

高血压构成了全球重大的公共卫生负担。尽管血管紧张素转化酶（ACE）抑制剂有益，但其不良反应促使研究人员寻找更安全的天然替代品。ACE抑制肽因其低毒性和高生物利用度而受到广泛研究关注。本文综述了从不同海洋鱼类物种中获取的这些肽类在制备、分离、纯化及体外活性评价方面的当前进展。原料来源被分为主要商业物种和次要或养殖物种，突出了物种和组织来源对肽生物活性的影响。酶解法，特别是单酶法和双酶法，是主要的制备方法。随后的分离与纯化步骤，涉及超滤（UF）、凝胶过滤色谱（GFC）和反相高效液相色谱（RP-HPLC），对于富集生物活性组分和鉴定新型肽序列至关重要。此外，经典的马尿酰-组氨酰-亮氨酸（HHL）-高效液相色谱（HPLC）测定法仍然是使用半数抑制浓度（IC50）值评估体外活性的标准方法。未来的工作强调整合体外与体内验证、人工智能辅助筛选以及加工副产物的可持续利用，以推动海洋肽作为新型抗高血压制剂的发展。

1. 引言

高血压是心血管疾病（CVDs）、中风和肾衰竭等严重并发症的关键风险因素。据世界卫生组织（WHO）2023年报告，全球约12.8亿30至79岁成年人患有此慢性病。目前临床管理主要依赖血管紧张素转化酶（ACE）抑制剂、钙通道阻滞剂（CCBs）和血管紧张素II受体阻滞剂（ARBs）。ACE是一种锌依赖性金属肽酶，作用于肾素-血管紧张素系统（RAS），在调节全身血压中起关键作用。虽然合成降压药疗效确切，但存在头痛、低血压、过敏反应甚至肾损伤等不良反应，并常伴有持续性咳嗽、味觉障碍和皮疹，严重影响患者生活质量。因此，开发安全、高效的天然降压替代品成为研究重点。在此背景下，源自食品源的生物活性肽因高生物利用度、长期服用副作用少及额外健康促进功能，成为极具前景的天然降压替代材料。海洋食物源ACE抑制肽来源于软体动物、鱼类、甲壳类、贝类和藻类等。由于独特的蛋白质谱和氨基酸组成，海洋生物被认为是开发天然ACE抑制肽的重要来源。1996年，Seki等人报道海洋源蛋白肽比畜禽和乳蛋白肽具有更高的ACE抑制活性。至今，研究人员已成功从金枪鱼、鲑鱼、鳕鱼、鲭鱼、大黄鱼、安康鱼和河豚等多种鱼类中分离鉴定出新型ACE抑制肽。短链肽因含有多重氢键和疏水基团，在结合ACE活性位点方面具有优势。本文总结了体外活性评价方法、鱼类原料来源、酶解制备方法、分离纯化方法以及肽及其衍生产品的ACE活性，旨在为开发用于新型降压药物的天然海洋鱼类源ACE抑制肽提供理论指导。文献检索策略覆盖了PubMed、Web of Science、Scopus、Google Scholar及CNKI和万方数据库，检索时间范围为1992年至2026年，重点涵盖近十年（2016-2026）的研究。

2. ACE抑制肽的体外活性评价方法

体外实验仍是ACE抑制活性评价的主要方法，HHL-HPLC法是经典方法。该方法以马尿酰-组氨酰-亮氨酸（HHL）为底物，ACE催化产生马尿酸（HA），通过反相高效液相色谱（RP-HPLC）结合C18色谱柱分离和定量HA，计算ACE抑制率并以半数抑制浓度（IC₅₀）表示。此法灵敏度高、定量准确，被公认为测量ACE活性的“金标准”。卡托普利的IC₅₀值为纳摩尔级别。文献指出，IC₅₀在0.27至1000 μM之间的ACE抑制肽具有降压潜力。基于IC₅₀值，ACE抑制活性可分为极低活性（>1000 μM）、低活性（500-1000 μM）、中等活性（100-500 μM）、高活性（10-100 μM）和极高活性（<10 μM）。根据结构表征水平，数据分为粗水解液、分离组分和纯化肽三个层次。粗水解液是未分级产物，分子量分布广，无肽序列鉴定。分离组分通过特定截留分子量（MWCO）的超滤（UF）膜或凝胶过滤色谱（GFC）获得，分子量范围逐渐缩小，但仍为肽混合物。纯化肽经最终RP-HPLC分离和串联质谱（MS/MS）鉴定，具有确定的分子量、明确的氨基酸序列和单独的IC₅₀值，为机理研究和定量构效关系（QSAR）建模提供了结构基础。

3. 海洋鱼类源ACE抑制肽的鱼类原料来源

本节将原料来源分为主要商业物种和次要或养殖物种。主要商业物种包括鲭科鱼类（如金枪鱼和鲣鱼）、鲑科鱼类和鳕科鱼类。例如，从长鳍金枪鱼暗色肉中获得肽FPPDVA和KFPWGDGN，IC₅₀分别为87.1 μM和297.5 μM。从大眼金枪鱼暗色肉中获得13氨基酸肽WPEAAELMMEVDP，IC₅₀为21.6 μM。从鲣鱼卵水解物中获得的肽WGESF等IC₅₀高于900 μM，活性较低；但从干鲣鱼的嗜热菌蛋白酶水解物中获得了四个极高活性肽，如IWHHT（IC₅₀=5.1 μM）。鲑科鱼类方面，从大西洋鲑鱼骨中纯化的八肽FCLYELAR的IC₅₀为0.25 μM，活性极高。鳕科鱼类方面，从大西洋鳕鱼皮中获得的肽MLGP、MWW和GPAGPSGP的IC₅₀分别为683.1、497.6和179 μM，显示中等活性。次要商业物种包括中小型海鱼（如沙丁鱼和乌鳢）、近海养殖经济鱼类（如大黄鱼和小黄鱼）以及其他小型鱼类（如军曹鱼、秋刀鱼、带鱼、鲐鱼、安康鱼、鮸鱼和狗母鱼）。例如，从欧洲沙丁鱼酶解物中筛选出的六种新型三肽和四肽，IC₅₀值在1.25至3.35 μM之间，均显示极高抑制活性。从条纹乌鳢肌原纤维蛋白水解物中分离的七肽VPAAPPK和八肽NGTWFEPP的IC₅₀分别为0.45 μM和0.63 μM。从大黄鱼肌球蛋白水解物中获得的六个肽IC₅₀在0.63至10.26 μM之间。结论指出，ACE抑制肽的活性因鱼种而异，即使同一鱼种的不同组织和蛋白组分，活性也差异显著，这与原料蛋白质谱和氨基酸组成差异密切相关。

4. 海洋鱼类源ACE抑制肽的酶解制备方法

酶解法是目前最广泛应用的方法，具有条件温和、安全性高、肽结构稳定、过程可控性好和可重复性高等优点。单酶法和双酶组合水解是主要方式。单酶水解研究中，通常采用多种蛋白酶筛选最优酶，再进行工艺优化以提高水解物活性。微生物蛋白酶因其低成本和高稳定性应用最广，动物蛋白酶也具有强底物裂解特异性，胃蛋白酶在某些情况下效果更佳。复合蛋白酶有时比单一蛋白酶产生更高活性的水解物。双酶水解通过同时或分步水解模式，充分利用不同蛋白酶的特定切割位点，表现出显著的协同效应。同时双酶水解是将两种蛋白酶同时加入反应体系同步催化。分步双酶水解则是按顺序依次加入两种蛋白酶进行逐步水解。多酶联合分步水解常用于模拟体内复杂消化环境，验证肽的体内消化稳定性。文章系统地整理了每种已报道肽的酶解、分离、纯化和鉴定方法及关键参数。

5. 海洋鱼类源ACE抑制肽的分离纯化

为获得单一生物活性肽片段，需对蛋白水解物进行连续、分步的分离纯化，随后通过鉴定和分子对接技术获得单个肽。分离纯化主要通过色谱技术实现，其中尺寸排阻色谱和RP-HPLC应用最广。超滤（UF）是第一步，常用MWCO为1、3、5和10 kDa的膜进行梯度分离，富集高活性组分。之后通过Sephadex G-25或G-15凝胶过滤色谱进一步分级，最后经RP-HPLC纯化筛选出纯化肽，并使用液相色谱-串联质谱（LC-MS/MS）或质谱（MS）鉴定。研究表明，超滤后水解物的ACE抑制活性通常会持续提高，但也存在活性下降的情况。经过连续分步分离纯化，最终组分的ACE抑制活性和纯度会逐步提升，最终获得单一肽成分，但最终纯化肽的活性可能极高也可能极低。肽鉴定后，采用分子对接技术表征纯化肽与ACE的结合模式和相互作用能。除化学ACE抑制试验外，离体血管舒张实验和在体动物实验对于评估生物活性肽的降压潜力至关重要。自发性高血压大鼠（SHR）模型被广泛用于体内抗高血压评价。文章强调，所评述的材料在结构表征水平上存在根本差异，结论应基于各材料所能支撑的证据水平得出。

6. 海洋鱼类源ACE抑制肽的独特特性

与陆生和非鱼类海洋来源的肽相比，海洋鱼类源ACE抑制肽在序列、理化性质和构效关系方面具有独特特征。首先，其氨基酸组成富含疏水性氨基酸，尤其是脯氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、缬氨酸、苯丙氨酸、色氨酸和酪氨酸，这些残基对结合ACE活性位点的S1、S1'和S2'亚基至关重要。其次，远洋鱼类暗色肉中的肌原纤维蛋白比例较高，由其衍生的肽活性通常优于胶原蛋白肽。第三，这些肽主要为短链肽，有利于口服生物利用度。第四，海洋鱼类物种多样性提供了无与伦比的蛋白质序列天然库，有助于发现多样化的肽序列。

7. 海洋鱼类源ACE抑制肽的抑制机制

ACE抑制剂的抑制机制可分为竞争性抑制、非竞争性抑制、反竞争性抑制和混合型抑制。在所评述的海洋鱼类源ACE抑制肽中，竞争性抑制是最常见的机制。非竞争性和混合型抑制也有报道。抑制机制对体内疗效有重要影响。竞争性抑制剂在病理状态下易被内源性底物取代，而非竞争性和混合型抑制剂则能维持抑制效果。肽的降压作用通过两条相互关联的生理途径介导：一是抑制ACE以减少血管紧张素II的产生；二是延长缓激肽半衰期，激活一氧化氮（NO）通路导致血管平滑肌舒张。L-NAME和吲哚美辛作为药理探针用于区分NO和前列腺素信号通路的相对贡献。SHR模型桥接了体外ACE抑制与体内复杂的血压调节。文章指出，尽管大量肽具有强效体外活性，但仅有少数进行了SHR体内验证，且无一进入人体临床试验，这反映了显著的转化差距。文章通过分类列出每条目的生物学验证状态，为优先选择具有多层次验证的候选物进行后续开发提供了实用指南。

8. 未来展望

未来工作应加强体外与体内综合活性评估，补充细胞水平和动物实验验证。应注重提高高活性目标组分的得率。需要拓展制备方法，探索新型辅助手段与传统酶解法的协同优化。应加强多功能筛选与协同效应评价。需充分重视原料的可持续利用，优先使用鱼类加工副产物。加速新兴人工智能（AI）技术的整合，如肽组学分析和机器学习辅助筛选，对于推进ACE抑制肽的研发和产业升级至关重要。