负载过氧化铜的双响应水凝胶通过氧气释放与促血管生成作用促进糖尿病创面愈合

《Gels》：Copper Peroxide-Loaded Dual-Responsive Hydrogel for Enhanced Diabetic Wound Healing Through Oxygen Release and Promotion of Angiogenesis

　　

糖尿病足溃疡（DFUs）因持续高血糖、缺氧、血管生成受损和慢性炎症而构成重大临床挑战。传统敷料调节这些病理过程的能力有限。本文报道了一种葡萄糖/pH双响应水凝胶（命名为CBOD），其通过苯硼酸接枝壳聚糖（CS-BA）与多巴胺修饰的氧化海藻酸钠（OSA-DA）之间的席夫碱键和硼酸酯键构建动态共价网络而成。过氧化铜（CuO2）纳米颗粒被包封于该网络内，形成CuO2/CBOD。在酸性（pH 5.5）和高糖条件下，竞争性结合与键水解促进网络松弛，从而促进氧气和铜离子的刺激依赖性释放。体外评估表明该水凝胶具有良好的细胞相容性，并能增强人脐静脉内皮细胞（HUVECs）的迁移和管形成能力。在糖尿病大鼠全层切除创面模型中，该水凝胶加速创面闭合，第14天闭合率接近100%。治疗与M1相关标志物白细胞介素-1β（IL-1β）和分化簇80（CD80）表达降低、M2相关标志物白细胞介素-10（IL-10）和分化簇163（CD163）表达升高，以及血管标志物分化簇31（CD31）和α-平滑肌肌动蛋白（α-SMA）表达增强相关。这些发现支持CuO2/CBOD作为糖尿病创面管理的多功能敷料的潜力。

论文解读文章

一、研究背景与问题提出

皮肤作为人体抵御外界环境的第一道屏障，其结构完整性对健康至关重要。正常创面愈合经历止血、炎症、增殖和重塑四个协调阶段，但在糖尿病患者中这一过程受到显著干扰。糖尿病足溃疡（DFUs）作为糖尿病的严重并发症，常长期滞留于炎症期，造成高发病率并带来沉重的全球经济负担。DFUs的持续存在与局部微环境失调密切相关：长期高血糖引发晚期糖基化终末产物积累和严重氧化应激，直接损害细胞功能；同时，外周微血管病变加剧组织缺氧。由此形成的缺血性和促炎性微环境抑制了血管生成反应，从而延缓创面愈合进程，使其无法超越炎症期。

传统临床干预手段，包括手术清创、负压创面治疗和保湿敷料，在创面管理中发挥重要作用，但可能无法充分应对持续性缺氧和血管生成受损的问题。此外，外源性生长因子（如血管内皮生长因子[VEGF]和表皮生长因子[EGF]）的局部应用受限于快速酶解和高昂的治疗成本。因此，亟需开发能够感知糖尿病微环境并提供多重治疗效果的响应性生物材料。

近年来，可响应pH、葡萄糖、活性氧（ROS）、温度等病理信号的刺激响应性水凝胶已成为先进创面管理中的有前景平台。凭借其高度水合、多孔且可调的三维细胞外基质（ECM）样网络，水凝胶为加速再上皮化提供了理想的湿润环境。天然多糖如壳聚糖（CS）和海藻酸钠（SA）已被广泛功能化。具体而言，引入动态共价键——如pH敏感的席夫碱键和葡萄糖响应的硼酸酯键——使水凝胶能够响应特定病理触发因素发生结构转变。糖尿病创面微环境通常呈酸性且渗出液中富含葡萄糖。因此，开发双响应水凝胶为治疗药物的时空可控递送提供了有前景的平台。

除响应性载体外，还需要有效的治疗载荷来缓解缺氧和促进新生血管形成。过氧化铜（CuO₂）纳米颗粒在生物医学应用中受到关注。在酸性环境中降解时，CuO₂可作为原位产氧库，具有缓解组织缺氧和支持细胞代谢的潜力。伴随释放的Cu²⁺可上调VEGF等血管生成因子，刺激内皮细胞迁移和毛细血管管形成。然而，游离CuO₂纳米颗粒在体内的直接应用受限于潜在快速降解，可能导致局部铜蓄积、细胞毒性和氧化应激。尽管近年来载体介导递送取得进展，但许多传统系统依赖被动扩散或逐渐的基质降解，对复杂糖尿病创面微环境的响应性有限，常表现出突释、疗效时限短以及与创面愈合过程中氧和铜需求变化不匹配等问题。

二、研究内容与结论概述

为应对上述挑战，研究人员设计了一种负载CuO₂纳米颗粒的葡萄糖/pH双响应水凝胶（CBOD），将氧气递送与促血管生成相结合用于糖尿病创面愈合。研究人员合成了苯硼酸修饰的壳聚糖（CS-BA）和多巴胺修饰的氧化海藻酸钠（OSA-DA）作为聚合物组分。CBOD水凝胶网络通过两种动态共价键交联：壳聚糖胺基与氧化海藻酸钠醛基之间形成的席夫碱键，以及苯硼酸与多巴胺儿茶酚基团之间形成的硼酸酯键。CuO₂纳米颗粒被包封于该动态基质中。研究人员假设，应用于糖尿病创面后，酸性和高糖微环境将通过葡萄糖竞争和酸诱导的动态键水解使水凝胶网络失稳，这种网络松弛有望调控CuO₂暴露并支持氧和Cu²⁺的持续、刺激依赖性释放。该研究系统评估了CuO₂/CBOD水凝胶的结构特征、双响应释放动力学和体外促血管生成活性，并在糖尿病大鼠全层切除创面模型中进行了体内评价。研究结果表明，该水凝胶在14天内实现了接近完全的创面闭合，并伴随炎症调控和血管生成的显著改善，支持其作为糖尿病创面管理多功能敷料的潜力。

三、主要关键技术方法

研究人员采用了以下关键技术方法：通过化学沉淀法合成CuO₂纳米颗粒，使用聚乙烯吡咯烷酮（PVP）作为稳定剂控制粒径并减少团聚；通过酰胺偶联反应将苯硼酸（PBA）接枝到壳聚糖上制备CS-BA，通过高碘酸钠氧化海藻酸钠后接枝多巴胺制备OSA-DA；将CS-BA与OSA-DA按3:1体积比混合制备CBOD水凝胶，并在其中包封CuO₂形成CuO₂/CBOD复合水凝胶；采用透射电子显微镜（TEM）、X射线光电子能谱（XPS）、傅里叶变换红外光谱（FTIR）、核磁共振氢谱（¹H NMR）、扫描电子显微镜（SEM）和流变学测试对材料进行表征；通过电感耦合等离子体质谱（ICP-MS）监测Cu²⁺释放动力学，使用溶解氧仪监测氧气释放；体外细胞实验采用CCK-8、活/死染色、划痕迁移实验和Matrigel管形成实验评估细胞相容性和促血管生成活性；体内实验采用链脲佐菌素（STZ）诱导的糖尿病SD大鼠全层切除创面模型（动物实验经瑞格生物科技动物伦理委员会批准，批准号IACUC 20240109-001），通过H&E染色、Masson三色染色、免疫组织化学（IHC）和免疫荧光（IF）染色评估创面愈合效果。

四、研究结果

4.1 CuO₂纳米颗粒的表征

TEM观察显示CuO₂纳米颗粒呈不规则片状纳米结构，存在堆叠和聚集现象。EDS元素图谱显示Cu和O均匀分布且共定位良好。动态光散射（DLS）分析显示粒径分布较窄，范围为200至350 nm。XPS分析中，Cu 2p高分辨谱在933.5和953.5 eV处呈现两个显著峰，伴随942.1和962.1 eV处的卫星峰，确认了铜（II）的存在；O 1s谱在530.7和532.5 eV处显示峰，分别归属于C=O和O-O过氧化物键，支持过氧化物结构的形成。

4.2 水凝胶前体的表征

FTIR和¹H NMR分析证实了PBA成功接枝到壳聚糖上，PBA接枝度为28.5 ± 0.5%；DA成功接枝到氧化海藻酸钠上，OSA氧化度为35.2 ± 1.9%，DA接枝度为27.5 ± 2.1%。

4.3 水凝胶的微观结构和流变学性质

SEM图像显示冻干水凝胶具有三维互连多孔结构，孔径范围为100至200 μm，CuO₂的掺入未明显破坏该多孔结构。频率扫描测试显示储能模量（G′）在0.1–100 rad/s范围内始终超过损耗模量（G″），表明水凝胶以弹性、类固体行为为主。CuO₂的掺入提高了G′和G″，可能归因于纳米颗粒提供了额外物理交联位点。应变扫描显示CBOD水凝胶的临界应变约为700%，而CuO₂/CBOD水凝胶在约250%应变处发生网络屈服。两种水凝胶均在12 h内达到溶胀平衡，CuO₂/CBOD的平衡溶胀比略低于CBOD。猪皮粘附测试和手指弯曲测试进一步证明了CuO₂/CBOD水凝胶的组织粘附性。

4.4 Cu²⁺和氧气的释放动力学

在无葡萄糖的pH 7.4缓冲液中，水凝胶的Cu²⁺释放极少；而在酸性高糖条件（pH 5.5，5 mg/mL葡萄糖）下，Cu²⁺释放加速，72 h时累计释放量达约48%。与CBOD相比，CuO₂/CBOD水凝胶表现出持续氧气释放，释放曲线在第4–5天左右达到平台期；酸性条件下产氧显著增加，高糖存在下进一步增强。降解实验显示，在无葡萄糖的pH 7.4缓冲液中，水凝胶12天后保留约92%初始质量；pH降至5.5时降解加速，剩余质量降至约55%；葡萄糖的存在也在生理pH下加速降解。这些结果证实了水凝胶的pH和葡萄糖双响应设计。

4.5 CuO₂/CBOD水凝胶的细胞相容性

L929成纤维细胞活力随CuO₂浓度变化：低于50 μg/mL时细胞活力维持在90%以上，超过100 μg/mL时诱导显著细胞毒性。CuO₂负载水凝胶仅引起略高于基线的ROS水平升高，而H₂O₂阳性对照诱导显著ROS升高。活/死染色和CCK-8实验支持水凝胶的细胞相容性。第5天时，与CuO₂/CBOD水凝胶共培养的HUVECs保持增殖和多极形态，而对照组细胞出现衰老样形态变化。

4.6 CuO₂/CBOD水凝胶的促血管生成效应

划痕实验显示CuO₂增强HUVECs迁移，50 μg/mL时效果最佳，72 h时相对迁移率为对照组的3.81倍。管形成实验中，经CuO₂/CBOD水凝胶提取物处理的HUVECs在12 h内形成互连的毛细血管样网络，产生278个管连接点，多于CBOD组和对照组。这种促血管生成反应可能与Cu²⁺的持续释放有关。

4.7 糖尿病创面体内愈合

在STZ诱导的糖尿病大鼠全层切除创面模型中，第3天时CuO₂/CBOD组创面闭合率达61.18%，显著高于3M商用敷料组（38.94%）和未处理对照组（37.09%）。第14天时，CuO₂/CBOD组创面接近完全闭合（99.88%），而对照组为87.63%。H&E染色显示第3天对照组出现广泛炎症细胞浸润，而CuO₂/CBOD组炎症反应显著减轻并出现早期肉芽组织形成迹象；第14天时CuO₂/CBOD组创面呈现连续、分层的上皮层，接近健康皮肤。Masson三色染色显示CuO₂/CBOD组胶原束更致密、排列更有序。

4.8 体内炎症调控

免疫组织化学染色显示，CuO₂/CBOD治疗显著降低了促炎细胞因子IL-1β和M1巨噬细胞标志物CD80的表达，同时增加了抗炎细胞因子IL-10和M2巨噬细胞标志物CD163的表达，表明该水凝胶能够减轻早期创面炎症并将局部免疫微环境转向抗炎的M2相关表型，从而支持组织修复。

4.9 体内血管生成调控

免疫荧光染色显示，第7天和第14天时CuO₂/CBOD组CD31荧光强度最高，表明新生血管形成增强；α-SMA染色的同步增加提示血管周细胞覆盖和血管成熟度提高。这些发现表明Cu²⁺和氧气的释放可能支持糖尿病创面组织中的血管修复。

五、总结与结论

研究人员开发了一种葡萄糖/pH双响应水凝胶（CuO₂/CBOD），以应对糖尿病创面中的缺氧、血管生成受损和炎症问题。通过引入动态席夫碱键和硼酸酯键，该材料在酸性和高糖微环境中表现出响应性释放特性。这种刺激响应性调控了CuO₂的分解，并支持氧气和Cu²⁺的持续释放。体外和体内研究结果表明，该递送系统促进血管生成并减轻局部炎症。CuO₂/CBOD敷料促进了组织修复，并在14天内实现了糖尿病创面的接近完全闭合。这些发现支持进一步研究CuO₂/CBOD作为糖尿病创面管理的响应性递送平台。