地塞米松调节胶质母细胞瘤细胞系的全球DNA甲基化与氧化性DNA损伤

《Cells》：Dexamethasone Modulates Global DNA Methylation and Oxidative DNA Damage in Glioblastoma Cell Lines

　　

摘要专业翻译 胶质母细胞瘤（Glioblastoma, GBM）仍是最具侵袭性的原发性脑肿瘤之一，其特征为快速进展、治疗耐药及预后不良。地塞米松（Dexamethasone, DEX）常规用于胶质母细胞瘤患者以减轻瘤周水肿并改善神经症状。然而，其对肿瘤细胞生物学及治疗应答的更广泛分子效应仍未完全阐明。本研究检测了地塞米松单药及与替莫唑胺（Temozolomide, TMZ）、丙戊酸（Valproic acid, VPA）或二甲双胍（Metformin, MF）联合用药对胶质母细胞瘤细胞活力、实时增殖、衰老相关β-半乳糖苷酶（Senescence-associated β-galactosidase, SA-β-gal）活性、细胞周期分布、全球DNA甲基化及氧化性DNA损伤的影响。地塞米松在胶质瘤细胞中诱导浓度和时间依赖性的全球DNA甲基化改变。在T98G细胞中，较短暴露时间增加5-甲基胞嘧啶（5-methylcytosine, m5C）水平，而较长孵育时间或特定联合处理条件则降低甲基化水平，提示存在动态表观遗传重塑。低浓度地塞米松与m5C含量增加相关，在含替莫唑胺的条件下亦然。相反，较高浓度地塞米松降低全球甲基化水平，该效应具有细胞系依赖性。在SW1783细胞中，高剂量地塞米松导致m5C含量降低以及8-氧代-2′-脱氧鸟苷（8-oxo-2′-deoxyguanosine, 8-oxo-dG）水平升高。地塞米松在延长暴露时间后亦降低T98G细胞的实时增殖，而替莫唑胺是与T98G细胞细胞周期改变相关的主要化合物。二甲双胍在所测条件下显示出相对有限的细胞毒性。除地塞米松公认的抗水肿和抗炎作用外，其还可能修饰胶质瘤的氧化还原及表观遗传状态，并影响细胞对替莫唑胺、丙戊酸和二甲双胍的应答。在考虑这些发现时，有必要考虑若干局限性。DEX、TMZ和MF浓度范围的上限比已报道的脑或脑脊液暴露水平高1至3个数量级，且实验在标准培养氧浓度（约18–21% O2）下进行，远高于脑组织中发现的氧水平（约2–6% O2）。此外，从T98G实验得出的结论仅适用于该细胞系，未经其他模型验证不能推广至胶质母细胞瘤。

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一、研究背景与目的

胶质母细胞瘤（Glioblastoma, GBM）是中枢神经系统中最具侵袭性的原发性星形细胞脑肿瘤，以不受控制的增殖、活跃的血管生成、侵袭性和凋亡逃逸为特征。其无进展生存期中位数约为6.9个月，确诊后5年生存率仅为9.8%，半数患者因肿瘤复发在术后2年内死亡。标准治疗方案为最大范围手术切除后联合放疗和替莫唑胺（Temozolomide, TMZ）化疗，但由于肿瘤弥漫浸润性生长，完全切除往往无法实现，复发频繁，预后仍然不佳。

DNA甲基化是哺乳动物基因组中最著名的表观遗传修饰之一，涉及甲基从S-腺苷甲硫氨酸共价转移至胞嘧啶第五位碳原子，由DNA甲基转移酶催化生成5-甲基胞嘧啶（5-methylcytosine, m⁵C）。m⁵C水平反映细胞的发育、分化和代谢状态。去甲基化可通过ten-eleven translocation（TET）蛋白介导的酶促氧化或与活性氧（Reactive Oxygen Species, ROS）相关的随机氧化过程发生。细胞内ROS升高可导致DNA氧化、突变、基因组不稳定、增殖改变和化疗耐药。因此，氧化性DNA损伤与DNA甲基化改变可能代表癌细胞适应的相互关联的动态过程。8-氧代-2′-脱氧鸟苷（8-oxo-2′-deoxyguanosine, 8-oxo-dG）是鸟嘌呤分子与羟基自由基直接反应的产物，是氧化性DNA损伤的广泛使用的标志物。

地塞米松（Dexamethasone, DEX）是合成糖皮质激素，具有强效抗炎、抗过敏和免疫抑制特性，常规用于减轻GBM患者瘤周水肿、降低颅内压和改善神经症状。然而，新出现的证据表明，地塞米松可能对胶质母细胞瘤患者产生不利影响，较长、较高剂量或特定治疗阶段的暴露与多个临床队列中较短的总生存期和无进展生存期相关。临床观察还提示地塞米松可能干扰多种抗癌治疗方式，包括放疗、化疗、肿瘤电场治疗、溶瘤病毒治疗和免疫治疗。因此，地塞米松的剂量、时机和细胞学后果是胶质母细胞瘤治疗中的重要问题。

本研究旨在分析地塞米松单药及与替莫唑胺、丙戊酸（Valproic acid, VPA）和二甲双胍（Metformin, MF）联合用药在GBM细胞系中的表观遗传和氧化还原相关效应，评估细胞活力、实时增殖、衰老相关β-半乳糖苷酶（SA-β-gal）活性、细胞周期分布、全球DNA甲基化和氧化性DNA损伤，特别关注m⁵C和8-oxo-dG作为氧化还原-表观遗传重塑的互补标志物。研究人员假设DEX可能通过氧化还原-表观遗传重塑修饰胶质母细胞瘤细胞生物学，并可能影响细胞对TMZ和VPA的应答。

二、主要技术方法

研究人员使用了以下关键技术方法：MTT比色法评估细胞活力并计算半数抑制浓度（IC₅₀）；流式细胞术结合碘化丙啶（Propidium iodide, PI）染色分析细胞周期分布；xCELLigence^?实时阻抗系统连续监测144小时细胞增殖动态；基因组DNA提取后经核酸酶消化、[γ-³²P]ATP末端标记和二维薄层色谱（Thin-Layer Chromatography, TLC）定量全球m⁵C含量；高效液相色谱（HPLC）结合二极管阵列检测器和电化学检测器串联定量8-oxo-dG含量；成像流式细胞术结合荧光底物检测SA-β-gal活性。细胞系包括人胶质母细胞瘤细胞系T98G（ATCC-CRL-1690）、U138（ATCC-HTB-16）、U118（ATCC-HTB-15）、间变性星形细胞瘤细胞系SW1783（ATCC-HTB-13）、人宫颈癌细胞系HeLa（ATCC-CCL-2）及人正常肺成纤维细胞系WI-38（ATCC-CCL-75），均购自ATCC。

三、研究结果

3.1 DEX、TMZ、VPA和MF在T98G胶质母细胞瘤细胞中的细胞毒性效应

通过MTT法评估药物诱导的细胞毒性。在低浓度（约60 μM以下），DEX、TMZ、VPA和MF对T98G细胞活力的影响相对有限且相当。各化合物单独测试中，VPA细胞毒性最低，DEX毒性最高，MF在所测条件下显示低细胞毒性。DEX与TMZ及DEX与VPA联合处理在低DEX浓度下维持细胞活力，但在TMZ高于100 μM和VPA 350 μM时活力降低30–40%。DEX与VPA混合物的毒性高于DEX与TMZ。DEX在广泛浓度范围内不影响MF处理。

3.2 DEX、TMZ和VPA处理后T98G细胞的实时增殖

利用xCELLigence系统实时监测T98G细胞增殖。48小时内各处理组增殖动力学相当。48小时后，DEX单药及含DEX联合处理组细胞指数显著下降，表明增殖减少和/或贴壁活细胞丢失。TMZ或VPA单药处理组维持较高细胞指数。DEX对T98G细胞增殖的抑制作用最强。

3.3 DEX和VPA对SA-β-gal活性的影响

通过成像流式细胞术评估SA-β-gal活性。DEX处理的WI-38成纤维细胞平均SA-β-gal活性较对照组增加1.32倍，与正常成纤维细胞衰老样表型诱导一致。相反，DEX处理的T98G细胞平均SA-β-gal活性较对照组降低1.57倍，可能反映代谢活性降低、溶酶体功能改变或贴壁活细胞丢失，而非经典衰老诱导。

3.4 DEX、TMZ和VPA对细胞周期的影响

通过流式细胞术分析细胞周期分布。WI-38和SW1783细胞中各处理未引起显著细胞周期分布改变。T98G细胞中，100 μM TMZ单药及与DEX联合均增加G1期细胞比例，而DEX单药或DEX与VPA联合未观察到该效应。TMZ是与T98G细胞细胞周期改变相关的主要化合物。

3.5 DEX对胶质瘤细胞系全球DNA甲基化的影响

通过二维TLC定量m⁵C含量。DEX诱导浓度和时间依赖性的全球DNA甲基化改变。在T98G、U138和U118胶质母细胞瘤细胞系中，较短DEX暴露（3–24 h）通常增加m⁵C含量。T98G细胞在24 h内各浓度均显著增加DNA甲基化，但48 h持续暴露后m⁵C水平相对早期时间点下降，提示长时间DEX处理期间发生动态DNA甲基化重塑。SW1783细胞显示不同模式，48 h后甲基化水平增加并保持相对稳定。HeLa细胞在3 h观察到最大增加，非肿瘤细胞系在3和24 h增加后缓慢去甲基化。

3.6 DEX/TMZ/VPA/MF联合处理对T98G全球DNA甲基化的影响

在T98G细胞中分析24 h联合处理对全球m⁵C含量的影响。低DEX浓度（尤其25 μM）与TMZ、VPA和MF联合时与m⁵C含量增加相关。DEX在25、50和100 μM时未显著降低TMZ相关的DNA甲基化增加，仅在200 μM时观察到去甲基化。与VPA联合时，m⁵C水平在DEX 50 μM时下降。二甲双胍单药诱导DNA去甲基化，在DEX 25 μM时被逆转。

3.7 DEX、TMZ和VPA处理的T98G和SW1783细胞DNA中8-oxo-dG分析

通过HPLC-电化学检测定量8-oxo-dG含量。T98G细胞中DEX 25–100 μM在TMZ存在下降低8-oxo-dG水平；DEX与VPA联合在整个DEX浓度范围内降低8-oxo-dG含量。SW1783细胞中DEX 25–50 μM在TMZ存在下降低8-oxo-dG水平，但高浓度DEX（100和200 μM）诱导8-oxo-dG含量增加；DEX 25–200 μM与VPA联合时8-oxo-dG增加。8-oxo-dG总体降低提示DEX的抗氧化效应以及DNA修复机制的诱导。

3.8 DEX与不同比例TMZ/VPA处理的T98G细胞DNA中m⁵C和8-oxo-dG分析

T98G细胞经DEX（50–200 μM）与不同TMZ/VPA比例联合处理24 h。联合处理总体降低全球m⁵C含量，伴随8-oxo-dG含量降低。全球DNA甲基化降低与氧化性DNA损伤增加无关，DEX与TMZ/VPA联合暴露产生m⁵C和8-oxo-dG水平的平行降低。

四、讨论与结论

研究结果表明DEX在胶质瘤细胞中诱导动态的、浓度、时间和细胞系依赖性的全球DNA甲基化和氧化性DNA损伤改变，并修饰胶质瘤细胞对TMZ、VPA和MF的应答。低浓度DEX（尤其25–50 μM）在含TMZ条件下通常与m⁵C含量增加相关；高浓度DEX趋向于降低全球DNA甲基化。SW1783细胞对高剂量DEX更敏感，表现为m⁵C降低和8-oxo-dG增加。T98G细胞中m⁵C和8-oxo-dG的平行评估显示全球DNA低甲基化不一定伴随氧化性鸟嘌呤损伤增加，反映DNA甲基化受DNA甲基转移酶严格酶促调控，而氧化性DNA损伤源于鸟嘌呤与ROS的相对随机直接反应，两者在联合处理下可分离。DEX在xCELLigence分析中产生最强的延迟性细胞指数降低，而TMZ是T98G细胞细胞周期再分布的主要化合物。DEX增加WI-38成纤维细胞SA-β-gal活性但降低T98G细胞SA-β-gal信号，呈细胞类型依赖性。

研究局限性包括：DEX、TMZ和MF浓度范围上限比已报道的脑或脑脊液暴露水平高1至3个数量级；实验在标准培养氧浓度（约18–21% O₂）下进行，远高于脑组织氧水平（约2–6% O₂）；T98G实验结论仅适用于该细胞系。VPA浓度（50–350 μM）和MF低端浓度（1–100 μM）在临床可达范围内。

结论：DEX在胶质瘤细胞中诱导浓度、时间和细胞系依赖性的全球DNA甲基化和氧化性DNA损伤改变。T98G细胞中较短DEX暴露通常增加m⁵C含量，而延长暴露和特定联合处理转向降低全球甲基化。SW1783细胞中高DEX浓度与m⁵C降低和8-oxo-dG增加相关。DEX还修饰TMZ和VPA的甲基化和氧化损伤应答，并在xCELLigence细胞指数中产生延迟降低。TMZ而非DEX或VPA是与T98G细胞细胞周期再分布相关的主要化合物。m⁵C和8-oxo-dG的平行评估表明全球DNA甲基化与氧化性鸟嘌呤损伤之间存在复杂的、背景依赖的关系。总体而言，研究结果支持DEX在胶质瘤细胞中具有生物学活性，可能修饰其氧化还原-表观遗传状态及对联合用药的应答。